Отчет по производственной практике в ООО « Молоко»

При приготовлении  препарата из бульонной культуры каплю лучше

размазать при легком подогревании стекла (это  способствует лучшему прикреплению материала к стеклу). Хорошие результаты получаются также при нанесении на стекло капли стерильного обезжиренного молока, с которым тщательно смешивают культуру.

1. Высушивание. После размазывания культуры по стеклу препарат высушивают, слегка подогревая его над пламенем горелки (препарат нужно держать мазком кверху).
2. Фиксация. Препарат несколько раз медленно проводят через пламя горелки. Фиксацию заканчивают в тот момент, когда при прикосновении стекла к руке ощущается легкий ожог. Этой операцией достигается следующее: бактериальные клетки при нагревании погибают (вследствие свертывания белка протоплазмы), плотно приклеивается к стеклу и не смываются при последующих операциях. Кроме того, фиксация обеспечивает лучшее окрашивание препарата, т.к мертвые клетки наиболее доступны для окраски.
3. Окрашивание. Для окрашивания применяют какую-нибудь одну окраску. Фиксированный мазок заливают краской и выдерживают 0,5-1 мин. Толстые мазки и мазки, содержащие клеточные элементы (ткани), окрашиваются более длительное время. Окраску микроорганизмов, плохо красящихся простыми способами, можно усилить подогреванием препарата при окрашивании или прибавлении к раствору красок химических веществ, способствующих более полному впитыванию краски препаратом. В качестве протрав используют карболовую кислоту, анилиновое масло, реже щелочи, уксусную кислоту, танин, бром, йод.

4. Высушивание окрашенного препарата. После окрашивания краску 
смывают   водой   и   препарат высушивают. К предметному стеклу с обоих

 

сторон  прикладывают фильтровальную бумагу, которая впитывает основную влагу. Затем препарат окончательно высушивают над пламенем горелки.

        Прижизненная  окраска. При просмотре живых препаратов для лучшей видимости микробов, жидкость можно слегка подкрасить, введя под покровное стекло небольшую каплю метиленовой сини или красный цвет, лучше видны и поэтому легче определить их форму.

        Негативный  метод. Каплю туши, не содержащей микроорганизмов, наносят на предметное стекло, тщательно смешивают с каплей исследуемой жидкости и смесь тонким слоем размазывают на поверхности предметного стекла. Когда темный слой высыхает, препарат без фиксации исследуют под микроскопом с иммерсионной системой, микробы резко выступают в виде ярко освещенных бесцветных телец на темном фоне препарата, получается как бы негативное изображение их.

        Метод окраски жидких нефиксированных препаратов из молока с аммиаком. Для просмотра жидких препаратов из молока, где казеин и жировые шарики затрудняют обнаружение микроорганизмов. Профессор С.А. Королев рекомендует следующий способ: на предметное стекло наносят петлю исследуемого молока, петлю насыщенного раствора метиленовой сини и петлю аммиака смешивают, покрывают покровным стеклом и подогревают до температуры кипения. При нагревании аммиака растворяют казеин. Препарат рассматривают в микроскоп, с сухой или иммерсионной системой. В этом случае кедровое масло наносят на покровное стекло.

Приготовление и окраска фиксированных  препаратов.

        Препараты фиксируют  и окрашивают, если надо рассмотреть  строение клеток, подсчитать количество микробов и т.д.

        На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю воды, вводят в нее иглой немного исследуемого материала, тщательно перемешивают и размазывают тонким слоем по поверхности стекла. Материал, взятый из жидких питательных   сред, в т.ч из   свернувшегося   молока, не   разводят   в капле воды

 

        

 (берется  петлей). Препарат высушивают при  комнатной температуре, для ускорения  высыхания его можно осторожно  подогреть мазком вверх над  пламенем горелки. Затем препарат  фиксируют, т.е проводят через  пламя горелки до тех пор,  пока не будет ощущаться легкий  ожог при прикосновении руки к стеклу. Цель фиксации - обеспечить лучшее прилипание мазка к стеклу, получить мазок наиболее восприимчивый к окраске. Фиксированный препарат покрывают раствором, какой- либо краски (метиленовой сини, насыщенным спиртовым раствором фуксина, разведенным в 5-10 раз водой).

        Для усиления действия краски препарат лучше окрашивать на слегка подогретом стекле до легкого  выделения пара. Краска сохраняется  на стекле в течении 2-3 мин. (метиленовая  синь чаще не более 1-2 мин.), после этого ее сливают, мазок промывают легкой струей воды и сушат.

        На мазок наносят  каплю воды, покрывают покровным  стеклом и 
исследуют под микроскопом с сухой системой при большом увеличении. Если 
пользуются     иммерсионной     системой,     то кедровое     масло     наносят

непосредственно на мазок, который перед этим необходимо высушить.

        Препараты из молока предпочитают окрашивать метиленовой  синью, т.к она слабо окрашивает казеин и достаточно интенсивно микробы. При этом получается препарат с более чистым фоном

        Для приготовления  препаратов из сред, содержащих сахар, а также культуры в бульоне, с  целью лучшей фиксации к капле  исследуемой жидкости добавляют  небольшую каплю стерильного  обезжиренного молока. Препарат сильно фиксируют и красят, как указано  выше.

        Если фиксированный и окрашенный препарат желательно сохранить долгое время, то по методу, предложенному Залесским, его покрывают плексигласом. Плексиглас растворим в эфире, дихлорэтане, ацетоне, хлороформе. Капля раствора плексигласа, нанесенная на сухой, покрашенный препарат, растекается по его поверхности, растворитель испаряется и на поверхности мазка остается довольно тонкая, прозрачная стекловидная пленка, защищающая, мазок и  позволяющая  применять иммерсию при  микрокопировании.  При  этом  нет

 

        

необходимости в покровных стеклах. Готовые препараты портятся при хранении и ими можно пользоваться длительное время.

Окраска по Грамму.

        При распознавании  микроорганизмов, большую пользу приносит окраска их по Грамму, поскольку разные виды бактерий неодинаково относятся к ней.

        Сущность метода заключается в том, что протоплазма  бактериальных клеток у одних  микроорганизмов образует прочное, нерастворимое в спирте соединение йода с краской, а у других, соединения не образуются. По Грамму следует окрашивать свежие культуры микроорганизмов.

        На предметное стекло наносят три мазка микробов: два  из них (один красящий по Грамму, а другой нет) контрольные; третий мазок - культура исследуемого микроба. Мазки высушивают, фиксируют и красят в течении 1-2 мин. карбоновым раствором генцианвиолета. Для получения более чистых препаратов рекомендуется покрывать мазок плоской фильтровальной бумагой и на нее наливать краску. После окраски препарат промывают водой и погружают на 1-2 мин. в раствор Люголя.

        Перед обработкой Люголевским  раствором препарат можно не обмывать водой, а осторожно удалить избыток краски фильтровальной бумагой. Препарат ополаскивают водой и обрабатывают в течении 1 мин. 95%-ым спиртом.

        Промыв препарата  водой, можно дополнительно окрасить его фуксином. Препарат рассматривается при сильном увеличении микроскопа с сухой системой (с каплей воды под покровным стеклом) или иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Грамму, темно-фиолетовые, не красящиеся -бесцветные или имеют цвет дополнительной окраски (фуксина). При недостаточной обработке спиртом все микробы сохраняют окраску, при чрезмерной - обесцвечиваются. Контрольные мазки с микробами -грамположительными и грамотрицательными позволяют установить правильность окраски культур. 

 

        Грамположительные микробы - почти все виды из семейства шарообразных Соссасеас (за исключением Micrococcus gonorrheae); почти все споровые формы; дрожжи; все молочнокислые бактерии. Грамотрицательные микробы - вся группа bacterium Coli, Bacterium aerogenes; флюоресцирующие бактерии.

                  Подсчет спор в камере Горяева. 
Обычно для счета микроорганизмов под микроскопом пользуются 
счетными камерами. При помощи камер можно определить общее содержание 
микробов в единице объема, а также количество почкующихся клеток дрожжей, 
мертвых клеток и др. Метод может применяться для подсчета дрожжей, крупных 
бактерий и спор плесеней. Мелкие бактерии, располагающиеся на дне камеры, не 
попадают в фокус микроскопа и остаются невидимыми в поле зрения. При 
подсчете    учитываются все    клетки,    расположенные    внутри    квадрата.

Пересеченные  пополам клетки считают только на 2 из 4 границ квадрата; клетки, расположенные  более чем на половину вне данного  квадрата, не учитывают. Наиболее часто  применяется камера Горяева. Счетная  камера Горяева имеет площадь 9 мм², объем камеры 0,9 мм³. Сетка счетной камеры разбита на 225 больших квадрата. Подсчитывают количество микроорганизмов в 5 больших квадратах по диагонали или по углам сетки и в середине. Т.к на одной камере Горяева имеются две сетки, то приготовляют 2 препарата : в первом считают количество клеток в больших квадратах общих сеток, во втором лишь в одной сетке. Т.о. подсчет ведут в трех сетках и подсчитывают среднее число клеток.  

4. Знакомство со  штаммами и способы  приготовления

заквасок.

Чистые  культуры молочнокислых бактерий и другие микроорганизмы (например, дрожжи) выделяют в специальных лабораториях и рассылают предприятиям в виде сухих и жидких заквасок (комбинаций штаммов), сухого и замороженного бактериального концентрата, а также отдельных штаммов; кроме того, эти лаборатории направляют на предприятия кефирные грибки. Способы приготовления заквасок:

     1. Приготовление закваски  на чистых культурах  - жидких и сухих заквасках и отдельных штаммах рекомендуется проводить беспересадочным способом по схеме:

Чистые  культуры 

закваски (комбинации штаммов) жидкие и сухие 

отдельные штаммы 
 
 

Лабораторная  закваска, приготовляемая в лаборатории на стерилизованном обезжиренном молоке 

в производство 

Производственная  закваска

приготовляемая  на произво-        в  производство

детве на пастеризованном или

стерилизованном обезжиренном

молоке

     Из  жидкой, сухой заквасок или отдельных  штаммов на предприятии (в лаборатории) приготовляют лабораторную закваску, которую используют для получения  производственной закваски. Лабораторную закваску можно применять также для заквашивания молока при производстве кисломолочных продуктов.

     Производственную  закваску используют для заквашивания молока при производстве кисломолочных  продуктов. 

 

     На  предприятиях, где отсутствуют условия  для приготовления закваски беспересадочным способом, может быть рекомендован, так называемый, трехпересадочный способ.

2. Приготовление закваски  на чистых культурах  - сухом и замороженном

бактериальном концентрате - рекомендуется проводить  по схеме:

Бактериальный концентрат (сухой или замороженный) 

производственная  закваска,

приготовляемая  на производстве

на пастеризованном  или

стерилизованном молоке 

в производство 

3. Приготовление закваски  для кефира проводится по схеме:

Кефирные  грибки

грибковая закваска, приготовляемая на пастеризованном обезжиренном        в производство или стерилизованном молоке