Використання програмних засобів при виконанні дисертаційної роботи

Біохімічні властивості  ізолятів кампілобактерій та диференціально-діагностичні тести проводили згідно офіційних  методик та ДСТУ ISO 10272 - 1:2007 "Мікробіологія харчових продуктів i кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення i підрахунку кампілобактерій (Campylobacter spp. )".

Перед висівом готували десятикратні розведення кожного змиву в стерильних розчинах хлориду натрію (0,85%) (рис. 2.). Із кожного розведення висівали по 0,1 мл суспензії на 2 чашки Петрі, рівномірно розподіляючи її по поверхні поживного середовища (рис. 3).

Інкубацію посівів проводили  на селективному поживному середовищі – агар Preston з домішкою 7% стерильної лізованої крові коня при температурі +42˚С в мікроаерофільних умовах. Через 24 – 48 годин культивування готували мазки з культур, які фарбували фуксином Циля в розведенні 1:5.

Кількість колоній підраховували  на репрезентативних чашках Петрі. За репрезентативну уважали чашку  з кількістю колоній не менш ніж 15 і не більш ніж 300. Кількість  колоніє утворюючих одиниць підраховували за формулою: A = N / V × d, де

А – кількість колоніє  утворюючих одиниць в 1 мл змиву; N –  кількість колоній на чашці Петрі; V – об’єм посіяної рідини в мл; d – індекс розведення.

Рис. 3.. Приготування десятикратних серійних розведень змивів із контамінованих стегенець

Рис. 4. Висів змивів з стегенець на селективне поживне середовище Preston

Для приготування вихідної суспензії дослідну порцію (маси чи об’єму) поміщали в середовище накопичення так, щоб одержати співвідношення дослідна порція/середовище накопичування 1:10 (маса/об’єм чи об’єм/об’єм). Приготовлену вихідну суспензію гомогенізували. Вподальшому вихідну суспензію інкубували у мікроаерофільній атмосфері за температури 37°С протягом від 4 до 6 годин, а потім продовжували інкубацію при температурі 41,5 °С. Після 44±4 годин культивування чашки перевіряли на наявність типових колоній для кампілобактерій. Культури, що виросли в середовищі накопичення, висівали стерильною петлею на поверхню селективного ізоляційного середовища mCCD агар (модифікований дезоксихолатний агар із активованим вугіллям) та на дві чашки селективного середовища Preston. До 1000 см³ поживного середовища mCCD попередньо додавали розчин антибіотиків: цефоперазон – 0,032 г і амфотеріцин В – 0,01 г, розчинених в 5 см³ дистильованої води. В середовище Preston (1000 см³) попередньо додавали розчин антибіотиків: цефоперазон – 0,02 г; ванкоміцин – 0,02 г; триметопрім лактат 0,02 г; амфотеріцин В – 0,01 г. Компоненти розчиняли у суміші етанолу і стерильної дистильованої води 50/50 (за об’ємом). Також вносили стерильну лізовану кров коня з розрахунку 5% до обєму середовища. Інкубацію посівів продовжили в мікроаерофільній атмосфері за температури 41,5°С. Для підтвердження належності культур, що виросли до видів Campylobacter відібрані колонії наносили штрихом на поверхню чашок з колумбійським кров'яним агаром, щоб одержати чітко відокремлені колонії. Чисті культури ідентифікували шляхом дослідження морфології, рухливості, здатності до мікроаеробного росту за температури 25°С, аеробного росту за температури 41,5°С та на оксидазну активність.

Визначення  кількості кампілобактерій за стандартом ISO 10272-2:2006, IDT "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення  і підрахунку (Campylobacter spp. )" проводили шляхом приготування ряду десятиразових розведень досліджуваного зразка, якщо продукт – рідина, або вихідної суспензії у випадку інших продуктів та наступний висів на щільні селективні середовища вихідної суспензії в об'ємі 0,1 мл. Чашки Петрі засівали використовуючи десятиразові розведення вихідної суспензії. Посіви культивували за температури 41,5^оС від 40 до 48 год в мікроаерофільній атмосфері. Колонії кампілобактерій, що виросли, відсівали на неселективне агаризоване середовище (колумбійський кров’яний агар). Ідентифікацію реізолятів проводили за морфологічними ознаками та за результатами біохімічних тестів. Подальші дослідження проводили у випадку підтвердження та ідентифікації 80% відібраних колоній. Спочатку відбирали чашки, які містили менше ніж 150 типових колоній і рахували ці колонії на поверхні щільного поживного середовища. У випадку, якщо чашки містили від 15 до 150 типових колоній кампілобактерій, то кількість кампілобактерій в дослідному зразку N вираховували як середнє арифметичне число колоній, що виросли на поверхні щільного поживного середовища від двох послідовних розведень. Визначення кількості кампілобактерій в досліджуваному зразку визначали за рівнянням (1):

, (1), де

∑ α – сума колоній, які відповідають критеріям ідентифікації, підрахованих на всіх чашках з двох послідовних розведень, де хоча б одна чашка містила не менше 15 типових колоній;

V – об’єм інокулюму, що висівали на кожну чашку в см³;

n₁ – кількість чашок, що засіяні з першого розведення;

n₂ – кількість чашок, що засіяні з другого розведення;

d – ступінь розведення, що відповідає першому збереженому розведенню ( d = 1, коли використовували нерозведену рідину як дослідний зразок). Отриманий результат заокруглювали до десятих і відображали результат отриманих досліджень як кількість кампілобактерій в 1 грамі.

У випадку, якщо коли дві  чашки мали менш ніж 15 типових колоній, визначення оціночного числа N кампілобактерій в досліджуваному зразку вираховували як середнє арифметичне від колоній нарахованих на двох чашках за рівнянням (2):

(2), де

∑α – є сума колоній, що містяться на двох чашках;

V – об'єм інокуляту, що висівали на кожну чашку в см³;

N – кількість чашок (в цьому випадку n = 2);

d – ступінь розведення вихідної суспензії чи першого висіяного розведення, що інокульовані або (d = 1 коли використовували нерозведену рідину як досліджуваний зразок).

У випадку, якщо дві чашки, що засіяні дослідним зразком (рідкі  продукти), або вихідною суспензією (всі інші продукти), або першим розведенням не містили жодної колонії, відображали результат таким чином: менш ніж 1 ∕ d × V кампілобактерій в 1 грамі (інші продукти), де d – ступінь розведення вихідної суспензії або першого розведення, що висіяне на середовище [d=10^o=1, коли дослідний зразок (продукт – рідина) інокульовані прямим посівом]; V- об’єм інокуляту, внесений в чашки, в см³.

 

Моніторинг ізоляції Сampylobacter spp. із продукції птахівництва

На першому етапі  дослідження нами було проведено  вивчення регіонального розташування підприємств, що займаються забоєм та переробкою птиці в Україні та їх кількості в межах однієї адміністративної одиниці (області) (рис. 5.).

Для оформлення даної діаграми використовувалось програмне забезпечення Microsoft office Exel.

 

Рис. 5Питома вага підприємств, що здійснюють забій та переробку птиці в адміністративних одиницях (областях) України, %

 

 

Таблиця 3

Регіональне розташування підприємств України, що займаються забоєм та переробкою птиці

Для оформлення даної таблиці використовувалось програмне забезпечення Microsoft office Exel.

 

№ п/п	Регіон	Область	Кількість забійних цехів
1	Північний	Чернігівська	3
2		Сумська	10
3		Житомирська	–
4	Східний	Харківська	5
5		Луганська	3
6		Донецька	4
7		Запорізька	1
8	Південний	Херсонська	1
9		Миколаївська	1
10		Одеська	1
11	Західний	Закарпатська	–
12		Івано-Франківська	4
13		Львівська	6
14		Волинська	2
15		Рівненська	2
16		Тернопільська	1
17		Чернівецька	2
18	Центральний	Хмельницька	3
19		Вінницька	11
20		Черкаська	7
21		Кіровоградська	–
22		Полтавська	–
23		Дніпропетровська	5
24		Київська	7
25		АРК	3
Всього			82

 

Всього в Україні  станом на 1.01.2011 року здійснює забій  та переробку птиці 82 підприємства, переважна більшість з яких розташована  у Вінницькій області – 13%, Сумській області – 12%, в Черкаській та Київській областях – 7%, відповідно. В Житомирській, Закарпатській, Кіровоградській і Полтавській областях підприємства по забою та переробці птиці відсутні.

В мазках виявляли дрібні грамнегативні бактерії зігнуті рухливі палички. Всі досліджувані ізоляти, які проявляли позитивні результати в тестах на продукцію каталази, цитохромоксидази і гідроліз гіпурату натрію, були віднесені до С. jejuni, як ті, що мають типові властивості.

Таблиця 4

Результати  мікробіологічних досліджень тушок птиці до патрання в умовах забійних цехів України (2009-2012 р.р.)

Для оформлення даної таблиці використовувалось програмне забезпечення Microsoft office Exel.

 

№ п/п	Назва підприємства	Здорова птиця					Хвора птиця
		кількість відібраних проб	кількість позитивних проб за показниками  досліджень				кількість відібраних проб	кількість позитивних проб за показниками  досліджень
			КМАФАнМ	патогенні мікроорганзми, у т.ч. сальмонели	кампілобактерії			КМАФАнМ		патогенні мікроорганзми, у т.ч. сальмонели			кампілобактерії
підприємства з забою і переробки  птиці в Сумській області
1	НВП "Еко-центр"	11	2	–		–	13	13	4			1
2	ТОВ"Птахопродукт-2007"	9	1	–		–	11	10	3			–
3	ПП "Боярчук"	7	1	–		–	12	9	3			–
4	ТОВ "Колос Агротрейд"	8	2	–		–	13	11	2			–
5	ТОВ А/ф "ім. Шевченка"	9	2	–		–	11	9	2			–
6	ТОВ "Ромни Птахоспілка"	12	2	–		–	12	10	3			–
підприємства з забою і переробки  птиці в Харківській області
7	ТОВ "Охоче"	11	3	–		–	12	11	3			–
8	ТОВ "Крос п/ф Зоря"	10	1	–		–	12	11	2			–
9	СТОВ "Старовірівський птахокомплекс"	9	3	–		1	11	10	4			3
підприємства з забою і переробки  птиці в Київській області
10	СГ ТОВ "Старинська п-ка"	10	3	–		–	11	11	5			2
11	ТОВ "Котома"	9	–	1		1	11	9	2			1
12	ВАТ ППР "Броварський"	9	3	–		–	10	9	3			–
13	ТОВ "Комплекс Агромас"	12	3	1		1	12	11	3			1
14	СФПГ "Добробут"	10	2	–		–	10	10	2			–
підприємства з забою і переробки  птиці в Чернігівській області
15	ТОВ "Березнянська птиця"	11	2	1	–		11	7			4	–
16	ТОВ МВК "Панвітек"	10	3	–	–		12	12			5	1
17	СТОВ ПФ "Прилуцька"	10	4	–	–		11	11			4	–
Всього:		167	37	3	3		195	174			54	9

 

На наступному етапі  провели мікробіологічні дослідження  на предмет ізоляції кампілобактерій  із сліпих кишок, відібраних із тушок птиці після патрання. Відбір проб проводили з непошкоджених сліпих кишок від тушок без патологоанатомічних та з патологоанатомічними змінами (табл. 3.3).

Таблиця 5

Результати  ізоляції Campylobacter spp. із сліпих кишок бройлерів в умовах забійних цехів Північно-Східного

регіону України (2009-2012 р.р.)

Для оформлення даної таблиці використовувалось програмне забезпечення Microsoft office Exel.

 

№ п/п	Назва підприємства	Тушки птиці без патзмін				Тушки птиці з патзмінами
		кількість відібраних проб, n	кількість виділених штамів, n			кількість відібраних проб, n	кількість виділених штамів, n
			C. jejuni	C. coli	С. lari		C. jejuni	C. coli	С. lari
підприємства, що забивають і переробляють птицю в Сумській області
1	НВП "Еко-центр"	18	1	–	–	27	2	2	1
2	ТОВ "Птахопродукт-2007"	22	2	1	–	29	4	1	–
3	ПП "Боярчук"	36	–	–	–	25	4	1	–
4	ТОВ "Колос Агротрейд"	25	1	1	–	30	2	1	–
5	ТОВ А/ф "ім. Шевченка"	24	–	–	–	34	2	–	–
6	ТОВ "Ромни Птахоспілка"	27	1	–	–	33	3	–	–
7	ТОВ "Колос Агротрейд"	28	3	1		37	5	1	–
підприємства з забою і переробки  птиці в Харківській області
8	ТОВ "Курганський бройлер"	27	1	–	–	31	5	2	–
9	ТОВ "Охоче"	26	1	–	–	29	3	–	–
10	ТОВ "Крос п/ф Зоря"	18	2	–	–	28	6	2	1
11	СТОВ "Старовірівський птахокомплекс"	20	1	1	–	30	5	1	–
підприємства, що забивають і переробляють птицю в Київській області
12	ЗАТ "Агрофірма "Березанська  птахофабрика"	22	2	–	–	30	5	1	–
13	СГ ТОВ "Старинська п-ка"	23	1	–	–	37	4	1	–
14	ТОВ "Котома"	24	2	1	–	31	7	3	–
15	ВАТ ППР "Броварський"	21	1	1	–	29	5	2	–
16	ТОВ "Комплекс Агромас"	24		–	–	26	7	2	–
підприємства, що забивають і переробляють птицю в Чернігівській області
17	ТОВ "Березнянська птиця"	18	1	–	–	25	7	1	–
18	ТОВ МВК "Панвітек"	16	–	–	–	27	3	1	–
19	СТОВ ПФ "Прилуцька"	19	1	1	–	26	5	1	–
Всього:		438	21	7	–	564	84	23	2