Разработка способов получения и применения автолизатов лактозосбраживающих дрожжей

     

Рисунок 2.1 – Схема проведения исследований

     Так же в качестве объекта исследования использовались:

     - дрожжевой автолизат, полученный  на основе биомассы дрожжей     Kl. marxianus;

     - закваска для сметаны (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis).

     Краткая характеристика закваски для сметаны.

     Температура сквашивания 28±2 °С. Продолжительность  сквашивания в лабораторных условиях 20 часов, на производстве 12 часов.

     Органолептические показатели:

     - консистенция и внешний вид:  сгусток плотный. Консистенция  жидкая, однородная, слабовязкая.

     - вкус и запах: чистый кисломолочный  с ароматом или без него.

     Кислотность: 90 °Т.

     Микроскопический  препарат: диплококки и цепочки кокков разной длины, встречаются отдельные  кокки. 

       В качестве сырья использовалась  молочная сыворотка, соответствующая  ОСТ 10 231-97.

     Для проведения экспериментальных исследований на различных этапах применялся комплекс физико-химических и биологических  методов:

1. определение температуры – термометрически по ГОСТ 9177-74;
2. изучение морфологии микроорганизмов проводилось методом микроскопирования окрашенных фуксином фиксированных препаратов на микроскопе «Микмед - 1» при увеличении 90х15;
3. определение массовой доли сухих веществ – рефрактометрически по ГОСТ 3626-83 и ГОСТ 8764-73;
4. определение титруемой кислотности - титрометрически по ГОСТ 8764-92 (по методикам для молочной сыворотки);
5. определение прироста аминоазота в % к СВ, подвергшемуся автолизу - методом формольного титрования;
6. отбор и подготовку проб для микробиологического анализа проводили по ГОСТ 26668-85, ГОСТ 26669-85; культивирование микроорганизмов – по ГОСТ 26670-85;
7. определение оптической плотности;
8. количественный учет микроорганизмов - методом предельных разведений [21].

     Сущность  метода формольного титрования для определения прироста аминоазота в % к СВ, состоит в следующем [22]:

     Контрольная проба. В коническую колбу наливают 5 см³ дистиллированной воды, 2,5 мл формоловой смеси и 3 мл 0,01 н щелочи. Жидкость приобретает ярко-красное окрашивание (рН смеси не больше 10). Содержимое титруют 0,01 н раствором серной кислоты до бледно-розовой окраски и прибавляют 0,2 мл 0,01 н раствора щелочи.

     Опыт. В коническую колбу емкостью 100 мл отмеривают 10 мл исследуемого раствора, 5 капель 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором щелочи до бледно-розового окрашивания. Записывают результаты. В эту же колбу прибавляют 2 мл 40% раствора формалина. Розовая окраска исчезает, тогда вторично титруют щелочью до бледно-розового окрашивания. Количество миллилитров щелочи, пошедшее на второе титрование, умножают на 1,94, получают содержание белка в процентах.

     Прирост свободных карбоксильных, а следовательно  и аминных групп, выражают в миллиграммах азота, для чего полученную разность, выраженную в миллилитрах 0,01 н щелочи, умножают на грамм-эквивалент азота (0,14). Вычисляют прирост аминоазота в % к СВ [33].

     Сущность  метода предельных разведений (посев  в жидкие среды, метод титрования) для количественного учета микроорганизмов заключается в том, что в пробирки с жидкой средой вносят строго 1 мл из различных разведений исследуемого продукта. После инкубации регистрируют наличие или отсутствие роста. На основании полученных данных можно рассчитать число клеток, содержащихся в 1 г (1 мл) исходного субстрата [21].

     Посев проводят из нескольких разведений с  таким расчетом, чтобы в опыт попало то разведение, при высеве из которого рост будет во всех параллельных сосудах, а также последующее разведение, которое не дает роста ни в одной из параллельных пробирок. Количество посевного материала во всех пробирках одинаково и соответствует 1 мл. После посева ставят в термостат на 30 °С. Затем визуально учитывается образование сгустка.

     В ходе экспериментальных исследований были использованы следующие приборы и оборудование:

     - термометр лабораторный;

     - микроскоп световой биологический по ГОСТ 8284-78 «Микмед-1»;

     - печь электрическая;

     - термостат лабораторный «ТС-1/80 СПУ», изготовленный по ТУ-9452-002-00141798-97;

     - бюретка лабораторная;

     - масло иммерсионное для микроскопии  по ГОСТ 13739-78;

     - стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

     - стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

     - стеклянная химическая посуда. 

     2.2 Исследование процесса получения  автолизатов лактозосбраживающих дрожжей

     Целью данного эксперимента являлось определение оптимальных условий получения автолизата лактосбраживающих дрожжей Kluyveromyces marxianus var.lactis.

     Эксперимент заключается в культивировании  культуры дрожжей в стерилизованной  сыворотке при 30 °С, в течение 2 и 7 суток, с последующим автолизом.

     Автолиз дрожжей проводился в разных условиях:

     - в термостате при 52  °С, в течение 48 часов;

     - при температуре 70 °С с выдержкой 10 минут.

       Для учета результатов автолизат  анализировался на сухие вещества (методом рефрактометрического анализа)  и на содержание аминных групп  (методом формольного титрование). Данные опытов представлены в   таблице 2.1.

      

     

     Таблица 2.1 – Влияние времени культивирования  и условий автолиза на получение автолизатов   

     По  результатам полученных данных построены  графики зависимости содержания сухих веществ (рисунок 2.2) и аминных  групп (рисунок 2.3) в автолизате от условий  автолиза.

     Анализ  результатов экспериментов показал, температура и время автолиза оказывает существенное влияние  на содержание сухих веществ и  аминных групп в готовом автолизате. Так из полученных данных следует, что  оптимальной температурой для автолиза является 52 °С, а временем 2 суток. При повышении температуры и уменьшении времени автолиза идет уменьшение содержание и сухих веществ на 0,2 ÷ 0,4, и аминных групп на   0,14 ÷ 0,35.

     Таким образом, оптимальные условия автолизата получены при температуре 52 °С, в течение 2 суток. При этом следует учитывать, что время культивирования в молочной сыворотке дрожжей 2 суток.   

     

     Рисунок 2.2 – Зависимость сухих веществ в автолизате от условий автолиза:

     1 – время культивирования 2 суток,  условия автолиза: t = 70 °С, τ = 10 мин;

     2 – время культивирования 2 суток,  условия автолиза: t = 52 °С, τ = 48 ч;

     3 – время культивирования 7 суток,  условия автолиза: t = 70 °С, τ = 10 мин;

     4 – время культивирования 7 суток,  условия автолиза: t = 52 °С, τ = 48 ч.

     

     Рисунок 2.3 – Зависимость содержания аминных групп в автолизате от условий автолиза:

     1 – время культивирования 2 суток,  условия автолиза: t = 70 °С, τ = 10 мин;

     2 – время культивирования 2 суток,  условия автолиза: t = 52 °С, τ = 48 ч;

     3 – время культивирования 7 суток,  условия автолиза: t = 70 °С, τ = 10 мин;

     4 – время культивирования 7 суток,  условия автолиза: t = 52 °С, τ = 48 ч.

     Дальнейший  опыт состоял в анализе влияния  кислотности сыворотки, пошедшей на автолизат, на содержание сухих веществ и аминных групп в автолизате.

     Для этого разработан ряд образцов, дрожжевых  автолизатов, полученных при помощи молочной сыворотки со степенью кислотности 83 ^оТ, а также образцами сыворотки сквашенной с использованием Lactobacillus acidophilus и Lactococcus lactis до кислотности 110 ^оТ, 173 ^оТ, 225^оТ и 283 ^оТ.

     Результаты  опыта представлены в таблице 2.2.

     Таблица 2.2 – Влияние кислотности на содержание сухих веществ и аминных групп  в автолизате  

     По  данным таблице построены графики  зависимости содержание сухих веществ (рисунок 2.3) и аминных групп (рисунок 2.4) в автолизате от кислотности сыворотки.

     Анализируя  полученные результаты экспериментов, можно сделать вывод, что наибольшее содержание аминных групп и сухих веществ в автолизате получается при использовании сыворотки с кислотностью 110 °Т.

     По  результатам данных экспериментов  можно сделать вывод, что наиболее целесообразно брать сыворотку  с кислотностью 110 °Т, временем культивирования  дрожжей 2 суток, условиями автолиза: температура 52 °С и время автолиза 2 суток.

     Рисунок 2.3 – Зависимость содержания сухих  веществ в автолизате от кислотности  сыворотки

     Рисунок 2.4 – Зависимость содержание аминных  групп в автолизате от кислотности  сыворотки

     2.3 Исследование влияния автолизата  на развитие заквасочной микрофлоры

     Целью данного эксперимента являлось изучение влияния автолизата дрожжей Kl. marxianus на развитие закваски для сметаны.  

     Эксперимент заключался в культивировании закваски с внесением в питательную  среду автолизата дрожжей, культивируемых в молочной сыворотке с разной кислотностью.