Разработка способов получения и применения автолизатов лактозосбраживающих дрожжей

     ВВЕДЕНИЕ 

     Еще с древнейших времен человек научился использовать дрожжи в своих целях: печь хлеб, изготовлять вино и пиво. Люди «общались» с ними, не зная их природы  и происхождения. Много веков  человек использовал эти организмы  в своих целях, даже не зная, что  это - живые существа. И лишь несколько  веков назад великий ученый Левенгук с помощью микроскопа увидел их. Началось изучение дрожжей, постоянно  сообщалось о новых открытиях  и исследованиях, которые продолжаются и по сей день.

     В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых  используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы  использования дрожжей: в различных  разработках, патентах и т.п. упоминается  более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессов [1].

     Дрожжевые клетки богаты витаминами группы В, в  особенности ниацином (В₆), рибофлавином (В₂), тиамином (B₁), фолиевой кислотой и В₁₂. Они содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов. Поэтому эти микроорганизмы целесообразно использовать для получения дрожжевого автолизата.

     К перспективной группе микроорганизмов  можно отнести лактосбраживающие дрожжи, способные расти на средах, являющихся побочными продуктами в техническом, сельскохозяйственном и молочном производстве.

     В связи с этим, целью дипломного проекта является исследование процессов получения автолизатов лактосбраживающих дрожжей и влияние автолизатов на кисломолочную микрофлору заквасок. 
 

     1 АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРЫ 

     1.1 Особенности метаболизма лактосбраживающих дрожжей

     Дрожжи  являются хемоорганогетеротрофами и используют органические соединения, как для получения энергии, так и в качестве источника углерода. Им необходим кислород для дыхания, однако при его отсутствии многие виды способны получать энергию за счёт брожения с выделением спиртов (факультативные анаэробы) [1].

     Рисунок 1.1 – Схема метаболизма дрожжей 

     Дыхание дрожжей

     Дыхание дрожжей сложный процесс биологического окисления, происходящий в клетках и сопровождающийся выделением энергии. Процесс дыхания дрожжей состоит из ряда последовательных окислительно-восстановительных реакций между водородом, отщепляющимся от карбоновых кислот в цикле трикарбоновых кислот, и молекулярным кислородом. Окисление пировиноградной кислоты происходит за счет кислорода воды и отщепления атомов водорода. Затем водород переносится на дыхательную цепь дрожжей, которая сходна с таковой высших растений. Она включает ряд дегидрогеназ, связанных с НАД-Н (пируват-, изоцитрат-, а-кетоглутарат-, лактат- и малатдегидрогеназы), флавопротеиды, кофермент Q (убихинон) и цитохромы. Особенностью дыхательной цепи дрожжей является наличие митохондриальной НАД–зависимой алкогольдегидрогеназы, катализирующей окисление этилового спирта, помимо алкогольдегидрогеназы I и II, локализированной в цитоплазме. В процессе аэробного дыхания дрожжи, окисляя один моль глюкозы, получают энергию, равную 2817 кДж, из которой только 10 – 25 % используют для своих нужд; остальная энергия выделяется в окружающую среду в виде тепла.

     Начальные этапы аэробного дыхания представлены на рисунке 1.2.

     Рисунок 1.2 – Начальные этапы аэробного дыхания

     Каждая  молекула пировиноградной кислоты  поступает в матрикс митохондрий  и здесь – в виде ацетильной группы (СН₃СОО –) – соединяется с веществом, которое называется коферментом А (или сокращенно КоА), в результате чего образуется ацетилкофермент А (ацетил-КоА). Ацетильная группа содержит два атома углерода (2С), поэтому для того чтобы она могла образоваться, пировиноградная кислота (ЗС) должна утратить атом углерода.

     Отщепление  атома углерода в виде СО₂ называется реакцией декарбоксилирования. Это – окислительное декарбоксилирование, поскольку оно сопровождается окислением путем дегидрирования, в результате чего образуется восстановленный НАД [2].

     Спиртовое брожение

     Наиболее  известное свойство многих дрожжей  – способность к спиртовому брожению. Многие виды дрожжей могут переключаться  с бродильного метаболизма на дыхательный и обратно в зависимости  от условий: при наличии кислорода  брожение ингибируется, и дрожжи начинают дышать, в отсутствии кислорода включается механизм спиртового брожения. Так  как кислородное дыхание –  энергетически более выгодный процесс, чем брожение, то выход биомассы дрожжей в расчете на единицу  используемого субстрата выше при  выращивании их в аэробных условиях, чем в анаэробных. Это явление  называется эффектом Пастера.

     Спиртовое брожение может идти не только в  анаэробных условиях. Если выращивать дрожжи в присутствии кислорода, но при высоком содержании глюкозы  в среде, то в этом случае дрожжи также сбраживают глюкозу. Таким  образом, глюкоза подавляет процессы анаэробного дыхания. Это явление  получило название эффекта Кребтри, или катаболитной репрессии.

     Многие  дрожжи вообще не способны бродить. По соотношению между этими двумя  процессами в метаболизме можно  выделить следующие группы дрожжей:

1. Дрожжи, существующие только за счет брожения и не способные расти в аэробных условиях. К ним относятся, например, вид Arxiozyma telluris, обитающий в кишечном тракте грызунов.
2. Активные бродильщики, интенсивно сбраживающие различные субстраты, но в анаэробных условиях, переключающихся на дыхательный обмен. Представители – Saccharomyсеs cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.
3. Слабые бродильщики в основном существующие за счет аэробного дыхания, но в аэробных условиях могут бродить, однако значительно менее интенсивно, чем виды из предыдущей группы. Это аскомицетовые дрожжи из родов Pichia, Debaryomyces, а также все способные к брожению базидиомицетовые дрожжи.
4. Дрожжи, существующие только за счет дыхания и не способные расти в анаэробных условиях. К этой группе относятся аскомицетовые дрожжи базидиомицетового аффинитета – Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces [3].

     Основными продуктами спиртового брожения являются этанол и углекислота, однако, в микроколичествах образуется также множество побочных соединений.

     Первой  фазой анаэробного дыхания тоже является гликолиз. Он дает в результате на каждую молекулу глюкозы две молекулы пировиноградной кислоты, две молекулы АТФ и две молекулы восстановленного НАД. При аэробном дыхании присоединившийся к НАД водород после ряда реакций, идущих с высвобождением энергии, передается, в конце концов, кислороду и  окисляется до воды. При анаэробном дыхании это оказывается невозможным, поскольку кислорода нет. Вместо этого водород вновь присоединяется к пировиноградной кислоте, так  что часть энергии, заключенной  в молекуле глюкозы, так и не извлекается (остается в конечном продукте брожения).

     Рисунок 1.3 – Схема анаэробного дыхания

     На  рисунке 1.3 приведены конечные этапы процесса, который носит название спиртового брожения. АТФ при спиртовом брожении образуется только на ранних его этапах – при расщеплении глюкозы до пировиноградной кислоты. Спиртовое брожение используется в производстве пива, вина и других спиртных напитков. В производстве хлебобулочных изделий используют выделяемый дрожжами в процессе спиртового брожения СО₂ – пузырьки этого газа заставляют подниматься тесто. Конечный продукт спиртового брожения – этанол – содержит еще довольно много энергии (в Бразилии, например, из него делают газохол, на котором ездят автомобили). Однако в отсутствие кислорода энергию из этанола извлечь нельзя [4].

     Общий выход АТФ при спиртовом брожении составляет две молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы.

     При молочнокислом брожении, так же как  и при спиртовом, на одну молекулу глюкозы образуются две молекулы АТФ. В конечном его продукте – молочной кислоте – сохраняется еще много энергии.

     Общее количество энергии, высвобождаемой из глюкозы при ее превращении в  этанол, составляет 210 кДж на 1 моль.

     В двух молях АТФ заключено 2 × 30,6 = 61,2 кДж.

     Следовательно, эффективность превращения энергии  при спиртовом брожении составляет 61,2 / 210 = 29,1%.

     Аэробное дыхание значительно эффективнее анаэробного. Связано это с тем, что при анаэробном дыхании значительная часть энергии остается «запертой» в этаноле или молочной кислоте. Энергия, заключенная в этаноле, так и остается для дрожжей навсегда недоступной и, значит, спиртовое брожение в смысле получения энергии – малоэффективный процесс. Из молочной же кислоты позднее может быть извлечено довольно большое количество энергии, если появится кислород. В присутствии кислорода молочная кислота превращается в печени в пировиноградную кислоту. Последняя поступает, затем в цикл Кребса и полностью окисляется до СО₂ и Н₂О, в результате чего дополнительно образуется большое количество молекул АТФ. Возможен и другой путь – за счет энергии АТФ из пировиноградной кислоты может вновь образоваться глюкоза в процессе, который представляет собой обращение гликолиза [2].

     Сбраживание и окисление лактозы дрожжами

     Способностью  сбраживать лактозу с образованием спирта и диоксида углерода обладают лишь немногочисленные представители дрожжевой флоры.

     Залашко Л.С. исследовала способность к  ассимиляции лактозы нескольких десятков штаммов дрожжей разных таксономических групп, предложив  разделить их по отношению к лактозе  на три группы: I – использующие лактозу и способные вызывать ее брожение; II – использующие   лактозу путем прямого окисления; III – не использующие лактозу [5].

     Превращение лактозы в этанол и углекислый газ при спиртовом брожении до стадии образования пировиноградной  кислоты идёт по гликолитическому пути, аналогично гомоферментативному молочнокислому брожению. Затем пировиноградная кислота подвергается декарбоксилированию под действием пируватдекарбоксилазы с образованием CO₂ и уксусного альдегида. Уксусный альдегид далее вступает во взаимодействие с НАД • Н₂, образовавшимся ранее при окислении 3-фосфоглицеринового альдегида. В результате образуется этанол [6]:

     Отличительной особенностью лактозоусваивающих  дрожжей, в сравнении с другими  микроорганизмами, утилизирующими лактозу, является  способность расти и  проявлять метаболическую активность в достаточно широком диапазоне  рН (3–6) и температур (24–34 °С). Оптимальными условиями развития дрожжей К. marxianus var. lactis, К. marxianus var. marxianus и С. kefyr являются: температура 28–32 °С, рН 4,5–5,5, однако некоторые штаммы К. marxianus var. тarxianus могут активно сбраживать лактозу в этанол при температуре 38 °С [7]. 

     1.2 Применение дрожжей в биотехнологии

     Некоторые виды дрожжей с давних пор используются человеком при приготовлении  хлеба, пива, вина, кваса и др. В  сочетании с перегонкой процессы брожения лежат в основе производства крепких спиртных напитков. Полезные физиологические свойства дрожжей  позволяют использовать их в биотехнологии. В настоящее время их применяют в производстве ксилита, ферментов, пищевых добавок, для очистки от нефтяных загрязнений [8].

     Также дрожжи широко используются в науке  в качестве модельных организмов для генетических исследований и  в молекулярной биологии. Пекарские  дрожжи были первыми из эукариот, у  которых была полностью определена последовательность геномной ДНК. Важным направлением исследований является изучение прионов у дрожжей [8].

     Хлебопечение

     В тесте и других полуфабрикатах хлебопекарного производства кислорода очень мало, поэтому дрожжи вызывают процесс  спиртового брожения. Образовавшийся в результате брожения углекислый газ  разрыхляет тесто и обеспечивает необходимую пористость изделий. В  присутствии кислорода (в аэробных условиях) в питательной среде  дрожжи разлагают сахар с образованием воды и углекислого газа. При этом энергии выделяется в 23 раза больше, чем при спиртовом брожении, поэтому  в присутствии кислорода дрожжевые  клетки интенсивно размножаются.

     Для нормальной жизнедеятельности дрожжей  необходимы жидкая среда, содержащая питательные  вещества, соответствующая реакция  среды и температурные условия.

     Жидкая  среда для развития дрожжей должна содержать сахар, азотистые соединения, минеральные соединения, витамины. Хлебопекарные дрожжи усваивают  глюкозу, галактозу, сахарозу, рафинозу, мальтозу. Сложные сахара (сахароза, мальтоза) под действием ферментов, дрожжей предварительно превращаются в простые. Из азотистых соединений дрожжи лучше всего усваивают  продукты гидролиза белка (аминокислоты, полипептиды), а также минеральные  соли, содержащие азот, например сернокислый  аммоний. Реакция среды, в которой  находятся дрожжи, должна быть слабокислая. Оптимальное значение рН среды 4,5 – 5. Большое значение для жизнедеятельности дрожжей имеют температурные условия. Для размножения дрожжей наиболее благоприятна температура 25 – 28 °С. Спиртовое брожение идет наиболее активно при температуре 30 – 35 °С.