Особенность дрожжей заключается еще и  в том, что каждая дрожжевая клетка покрыта специфической оболочкой  – кутикулой. С точки зрения кормовых достоинств это имеет свои положительные и отрицательные стороны [13].

     Производство  витаминов

     Витамин РР (никотиновая кислота)

     Одним из наиболее распространенных биотехнологических способов получения коферментной формы никотиновой кислоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД) является выделение (экстракция) его из микроорганизмов, как правило, из пекарских дрожжей. Для повышения содержания НАД в дрожжевых клетках культивирование проводят на средах с предшественниками синтеза никотиновой кислоты. Так, при добавлении в среды культивирования аденина или самой никотиновой кислоты получают до 12 мг НАД на 1 г клеток (по сухой массе) [14].

     Витамин D (кальциферол)

     Впервые кальциферол был выделен из рыбьего  жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Он получил название витамина D₃, так как ранее из растительных масел был выделен эргостерин под названием витамин D, при облучении которого получили витамин D₂ — эргокальциферол (кальциферол — в переводе «несущий кальций»).

     В настоящее время кальциферол  производят из эргостерина с применением  УФ–облучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5 — 10% эргостерина.

     В качестве промышленного источника  эргостерина используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вследствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования происходит накопление в клетках дрожжей  сквалена (предшественника эргостерина). Индукция синтеза эргостерина начинается при строго определенной концентрации кислорода от 0,03 до 2%. При этом среда должна содержать избыток углеводов и малое количество азота. По окончании процесса спиртового брожения дрожжи отделяют от барды и вносят в питательную среду необходимое количество источников углерода, азота и фосфора. Ферментацию ведут в аэробных условиях 12 — 20 ч, по окончании которой клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости, добавляют антиоксиданты и сушат. Обычно в такой биомассе содержание эргостерина достигает 1,5%.

     При дальнейшем УФ–облучении эргостерина получают витамин D₂, который либо используется как пищевая добавка, либо подвергается дальнейшей обработке с целью получения кристаллического витамина D₂.

     При получении эргостерина из дрожжеподобных грибов рода Candida сухую массу грибов экстрагируют петролейным эфиром для  извлечения остаточных углеводородов. Полученная таким образом липидная фракция называется «микробный жир» и является побочным продуктом микробиологической промышленности. Эта фракция может  быть использована как источник не только эргостерина, но и убихинона, а также других жирорастворимых  соединений. Для грибов рода Candida характерно, что при переходе от периодического культивирования на углеводородах  к непрерывному, в клетках сохраняются как уровень образования стеринов, так и относительное содержание в них эргостерина.

     Убихиноны (коферменты Q)

     Убихиноны в последнее время вызывают интерес  как перспективные лечебные препараты. С одной стороны, они синтезируются  в организме животных и человека, делая необязательным их поступление  с пищевыми продуктами, что отличает их от группы витаминов.

     С другой стороны, недостаток убихинонов ведет к нарушениям в обменных процессах, характерных для проявлений недостаточности витаминов групп  В и К. Убихиноны являются регуляторами тканевого дыхания, окислительного фосфолирирования в цепи транспорта электронов и за счет высокой специфичности проявляют свой регуляторный эффект.

     С практической стороны наибольший интерес  вызывают высшие гомологи: убихинон–9 (KoQ₉) и убихинон–10 (KoQ₁₀). Убихинон–10 является коферментом организма человека, вследствие чего на его основе создан лекарственный препарат Ubichynon compositum, проявляющий общетонизирующее, антиоксидантное и иммуностимулирующее действие.

     В производстве убихинонов применяются  биотехнологические методы, в основе которых лежит экстракция KoQ из биологического материала. В промышленном производстве убихинонов в качестве субстрата  используются как растительные ткани (каллус риса или опухолевые ткани Carthamus tinctorius), так и микроорганизмы с  высоким содержанием убихинонов, например дрожжи Cryptococcus curvatus и грибы Candida maltosa [15].

     Применение  в качестве модельного объекта.

     Многие  данные по цитологии, биохимии и генетике эукариот были впервые получены на дрожжах рода Saccharomyces. Особенно это положение касается биогенеза митохондрий: дрожжи оказались одними из немногих организмов, способных существовать только за счёт гликолиза и не гибнущих в результате мутаций в геноме митохондрий, препятствующем их нормальному развитию. Для генетических исследований важен короткий жизненный цикл дрожжей и возможность быстрого получения большого числа их особей и поколений, что позволяет изучать даже очень редкие явления [8].

     В настоящее время ведется разработка питательных сред для роста полезных бактерий с добавлением автолизатов дрожжей. В основном используются лактосбраживающие дрожжи.  

     1.3   Способы получения, состав и  свойства автолизатов дрожжей

     Дрожжевые автолизаты применяют для приготовления  основного питательного субстрата  в плотных агаровых средах.

     При автолизе (самопереваривание) собственные  ферменты клетки растворяют оболочку и другие клеточные структуры, вследствие чего происходит разжижение массы и  освобождение веществ клетки [16].

     Автолизаты  дрожжей получают плазмолизом с  последующим протеолизом белковой протоплазмы дрожжевой клетки. Они  содержат богатый комплекс биологически активных веществ, синтезированных  клеткой в процессе роста. Опытная  норма расхода автолизата в пересчете  на прессованные дрожжи 50 – 60 кг на 1 т мелассы. Выход дрожжей возрастает 5–6%. Для приготовления автолизатов используют санитарный брак прессованных и сушеных дрожжей, а также нестандартную продукцию.

     Клеточная оболочка сушеных дрожжей более  проницаема, чем прессованных, что  значительно облегчает плазмолиз. Кроме того, часть вегетативных форм посторонней микрофлоры погибает при  высушивании. В связи с этим санитарный брак прессованных дрожжей целесообразно  высушивать и хранить вместе с  отходами сушеных дрожжей с последующим  использованием для приготовления  автолизатов [17].

     Существует  около десятка методов получения  дрожжевых автолизатов, ниже приведены  основные из них.

     Автолизат в присутствии  поваренной соли. Сушеные дрожжи размачивают в воде в соотношении 1:4 и тщательно перемешивают, затем добавляют NaCl (2,5% к массе сушеных дрожжей) и выдерживают в термостате при температуре 48–52 °С в течении 12–18 часов, затем жидкость кипятят 1 час [17].

     Автолизат в присутствии  суперфосфата. Прессованные дрожжи размешивают в вытяжке суперфосфата (1:1) и помещают в термостат на 48 часов при температуре 45 °С. По окончании автолиза жидкость кипятят 1 час. Вытяжку готовят при разведении одной части суперфосфата в двух частях воды [17].

     Автолиз с культурой L.delbruckii. Этот способ используют в Чехословакии для получения автолизатов в лабораторных и промышленных условиях.

     В лабораторных условиях дрожжи суспендируют в воде в соотношении 1:1, нагревают  до 47–49 °С и инокулируют с L.delbruckii. В течении первых 10 часов трижды через равные промежутки времени добавляют сахарозу по 10 г на 1 кг исходных дрожжей. Автолиз продолжается 72 часа. Полученный автолизат фильтруют, а затем стерилизуют [17].

     Дрожжевой автолизат 1. Для его приготовления можно использовать прессованные или сушеные дрожжи. 200 г прессованных дрожжей размешивают со 100 мл водопроводной воды (100 г сушеных дрожжей с 400 мл воды), добавляют 0,15% поваренной соли к массе прессованных дрожжей (0,5% к массе сушеных). Смесь помещают в термостат при 50 °С на 48 часов, затем нагревают до кипения, фильтруют через складчатый фильтр, разливают в стеклянную посуду и стерилизуют при 0,1 МПа 30 минут [18].

     Дрожжевой автолизат 2. Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал около 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20–литровую бутыль). Бутыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около 60 °С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1–2 раза в сутки). Конец автолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Автолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах [17].

     Качество  автолизата ухудшается, если процесс  протекает при температуре, ниже 58 ^°С. По окончании автолиза в бутыль добавляют тройное количество теплой водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16 литров воды). Разведенный автолизат помещают в автоклав для стерилизации при температуре 120–123 °С на 30 минут. Оставляют на несколько дней для отстаивания.

     Дрожжевой автолизат 3. К 1 кг сушеных дрожжей, предварительно размельченных в фарфоровой ступке, добавляют 825 мл дистиллированной воды. Взвесь прогревают при 90–92 °С 10 минут. Центрифугируют для отделения дрожжевых клеток. Центрифугат отсасывают пипеткой и стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца. Для проверки стерильности 2–3 мл экстракта засевают в 10 мл питательного бульона и выдерживают в течении 3 суток при 30 °С. Дрожжевой экстрат сохраняется впрок при 4–10 °С без изменения активности до 12 месяцев [19].

     Дрожжевой автолизат 4. Для приготовления дрожжевого автолизата 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 дм3 воды и помещают в термостат при 55–58 °С на 3 суток. Затем автоклавируют при 118 °С в течении 15 минут и фильтруют через складчатый фильтр. Осадок промывают таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составило 4 дм³.

     Фильтрат  нейтрализуют 20%–м раствором едкого натра до рН 6,8, разливают в пробирки и стерилизуют при 121–123 °С 10 минут [20].

     Анализ  рассмотренных выше способов приготовления  автолизатов показал, что в каждом случае для его приготовления  необходима температура выше 45 °С. Так же прослеживается зависимость во времени выдержки, которое должно быть не меньше 2 суток. Время можно уменьшить повышением температуры автолиза. Все способы приготовления включают стерилизацию и фильтрацию готовых автолизатов.  
 
 
 
 
 
 
 
 

     2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 

     2.1 Организация работы и методы  исследований

     Экспериментальные исследования проводились в лабораториях кафедры прикладной биотехнологии  Северо-Кавказского Государственного Технического Университета. Исследования проводились поэтапно в соответствии со схемой, представленной на рисунке 2.1.

     Основным  биологическим объектом исследования являлись живые клетки дрожжей Kluyveromyces marxianus var.lactis (Kl. marxianus). Дрожжи получены из ВНИМИ (Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности, г. Москва).

     Синонимы: Saccharomyces lactis, Zygosaccharomyces lactis, Kluyveromyces lactis.

     Рост  на солодовом экстракте: после трёх суток культивирования при микроскопировании  обнаруживаются сферические или  немного вытянутые клетки размером (2,0 – 6,5)х(3,0 – 8,0) μм, расположенные одиночно, попарно, или небольшими скоплениями; наблюдается образование осадка на дне и стенках пробирки, также возможно наличие тонкой плёнки на поверхности.

     Рост  на сусло-агаре: спустя месяц культивирования  штриховая культура окрашивается в  кремовый цвет с оттенком коричневого  или серого цвета, поверхность колоний  матовая, гладкая, может иметь оттенок  розового цвета; края колоний ровные, иногда волнистые.

     При микроскопировании культуры, выросшей на кукурузном агаре, может наблюдаться  развитие рудиментарного псевдомицелья, который лучше развивается в  анаэробных условиях; при культивировании  в аэробных условиях он чаще всего  отсутствует [21].

     Рост  на среде Сабуро: штриховая культура имеет белое окрашивание; поверхность колоний гладкая; края колоний ровные, иногда волнистые.