Методы исследования эндокринной системы в норме и патологии

Помимо  проблемы выделения гормонов, существенную трудность представляет собой их сохранение – стабильность гормона. После высвобождения из железы некоторые гормоны быстро распадаются и циркулируют в крови в виде фрагментов. Лучше всего это видно, вероятно, на примере ПТГ, который вскоре после выделения в кровь распадается на аминоконцевой и карбоксильноконцевой фрагменты. Последний фрагмент имеет гораздо более длительный период полужизни в крови, чем аминоконцевой. Однако биологической гормональной активностью обладает именно аминоконцевой фрагмент. При выработке антител к нативному ПТГ у иммунизированного животного могут появиться антитела к аминоконцевому, карбоксильноконцевому или обоим фрагментам молекулы. Нормальные колебания концентрации ПТГ различаются в зависимости от специфичности антител, используемых для его определения.  
Другие гормоны, такие, как глюкагон и АКТГ, быстро разрушаются в плазме под действием содержащихся в ней протеаз. Для того чтобы избежать этого, необходима специальная обработка проб. Как правило, при получении их в пробирки добавляют ингибиторы протеаз, такие, как трасилол или бензамидин. 
Другая методическая проблема возникает в том случае, когда гормоны секретируются в разных формах. Существуют, например, различные формы гастрина — «минигастрин», «малый гастрин», «большой гастрин» и «очень большой гастрин». С помощью большинства методов определения гастрина при непосредственном анализе проб не удается различить эти формы. 
В результате пробы предварительно следует подвергнуть гельфильтрации, чтобы убедиться в присутствии разных физических форм гормона. Это относится и к другим гормонам, таким, как пролактин, инсулин и АКТГ. Более крупные формы обычно являются предшественниками меньших биологически активных нативных молекул.³²

Кроме перечисленных в данной работе методов  исследования эндокринной системы, в практику внедряются новейшие технологии, основанные на нанотехнологиях и молекулярных технологиях. Хочу отметить новую Российскую программу  «Протеомика в медицине и биотехнологии», цель которой — внедрение постгеномных технологий в области здравоохранения в практику. «Инвентаризация белков и пептидов различных органов и тканей позволит определить параметры нормы у здоровых людей, а также создать новые высокочувствительные белковые и пептидные диагностикумы  многих заболеваний».³³ Протеомика изучает обмен белков в живом организме: их синтез, взаимодействие и распад. Комплексное изучение спектра белков может ускорить разработку новых диагностических и терапевтических средств. Ярким примером является поиск биомаркеров для ранней диагностики злокачественных опухолей. На текущий момент в ходе исследований в разных лабораториях мира уже выявлено ряд новых белков, служащих биомаркерами раковых опухолей различной локализации. Важным аспектом является разработка комплексных панелей биомаркеров, позволяющих с большей достоверностью выявлять наличие заболевания. Помимо злокачественных опухолей, активно исследуются биомаркеры эндокринных, сердечно-сосудистых, лёгочных, желудочно-кишечных и многих других заболеваний.³⁴

Большое количество научных исследований и  разработок по проблемам диагностики  ведётся за рубежом. Наука развитых стран шагнула намного вперёд, используя нанотехнологии, в том  числе информационные и биологические.  Специалистам из университета Калифорнии удалось создать управляемый обыкновенным компьютером микрочип, который одновременно выполняет более тысячи реакций. Система основа на работе микроструйных каналов, которые могут дозировано подавать мельчайшие количества веществ. Чтобы обнаружить нужную молекулу, которая будет связываться с белковым ферментом, тем самым, ускоряя или замедляя определённый процесс в клетке, необходимо провести большое количество реакций. Именно их и осуществляет "лаборатория на чипе" (в обычных условиях поиск может занять годы). В данном случае микрочип в качестве теста искал возможный ингибитор фермента карбоангидразы быка. В результате тысячи циклов сложных процессов, таких как отбор пробы, смешивание нескольких реагентов и последовательное микроканальное прополаскивание, всё это было проделано устройством в течение всего лишь нескольких часов. Сейчас учёные анализируют полученные данные, причём делать это приходится вручную. В будущем же инженеры, химики и биологи надеются автоматизировать процесс.  Следующим шагом станет подбор реакций, которые бы мог проводить микрожидкостный чип. В первую очередь будут рассматриваться те, где количество исходных доступных веществ мало. Биологи, в частности, предлагают использовать новинку для исследования гормонов и ферментов.³⁵

Ещё одним из интересных и новых стал метод   плазмонного резонанса. SPR-диагностика (от Surface plasmon resonance) — метод определения констант связывания макромолекул, основанный на явлении поверхностного плазмонного резонанса. Спектроскопия оптического поглощения — один из старейших методов физико-химического анализа биомолекул. Однако невысокие его чувствительность и пространственное разрешение не позволяют изучать процессы с участием низких концентраций белка. Учёным из Беркли удалось «продлить век» оптическому методу за счёт сопряжения его с другим принципом, применяемым в биофизических и биохимических исследованиях, — плазмонным резонансом. Оказалось, что в спектре упругого рассеяния на наночастицах золота, введённых в клетку, могут появляться специфические «провалы», соответствующие частотам, на которых поглощают некоторые биологические молекулы (например, металлопротеины). Исследователи называют этот эффект миграцией энергии плазмонного резонанса и объясняют его непосредственным взаимодействием частиц золота с адсорбирующимися на них молекулами белка. Предложенный метод обладает невиданной ранее чувствительностью: с его помощью можно определять если и не единичные молекулы белка, то, по крайней мере, их десятки. Прямые оптические методы измерения биологических взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса конкурируют по чувствительности с традиционными методиками, использующими радиоактивные, ферментные, флуоресцентные метки для детектирования участвующих в реакции молекул. Вместе с тем, они имеют целый ряд преимуществ, таких как возможность следить за протеканием реакции в реальном времени, а также большая надежность и достоверность результатов при меньшем числе операций. Последнее преимущество связано с тем, что прямые оптические методы регистрируют непосредственное изменение толщины биомолекулярного слоя на поверхности чувствительного элемента в результате реакции между тестируемым компонентом раствора и рецепторным слоем, иммобилизированным на поверхности.³⁶

К современным  общелабораторным методам диагностики  и исследования живых систем, которые  могут применятся для изучения эндокринной  системы, можно отнести и использование  биосенсоров. Медицинские биосенсоры в скором времени позволят проводить лабораторные анализы быстро и надежно даже при отсутствии специальных навыков.³⁷

Химические (биологические) сенсоры – это тип аналитических устройств, которые служат для качественного и количественного определения химических (биологических) веществ. Обычно сенсор состоит из следующих частей  (Рис.2.1.):

• Распознающий элемент (он также может быть назван рецепторным слоем) представляет собой вещество, которое способно селективно взаимодействовать с аналитом.
• Трансдьюсер (англ. Transducer – преобразователь, датчик) преобразует химическое или биологическое взаимодействие в электрический сигнал.
• Система сбора и обработки данных служит для усиления и анализа сигнала и отображения результатов.

Биологические сенсоры отличаются от химических только тем, что они направлены на детектирование органических молекул, важных для живых  организмов: высокомолекулярных, таких  как белки, ДНК, и низкомолекулярных, например, глюкозы и мочевины. В  данном обзоре обсуждаются основные распознающие элементы биологических  сенсоров; как и в химических сенсорах, основное предъявляемое к ним требование – способность улавливать определенный аналит и не реагировать на посторонние вещества, присутствующие в образце.

Необходимо  отметить, что разработка сенсоров является междисциплинарной задачей, которая требует участия широкого круга специалистов: физиков, инженеров, химиков, биологов, врачей, экологов. Кроме  очевидных требований, предъявляемых  к новым сенсорам, таких как  простота эксплуатации, дешевизна, высокая  точность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации (это связано с  развитием нанотехнологий), иногда возможность работать в непрерывном  режиме, а иногда даже – возможность  внедрения в человеческий организм.³⁸

 
Рис.2.1. Схема биосенсора.

Физики  и инженеры помогают медицине и биологии не только в совершенствовании методик, но и в производстве новой, более  точной и мобильной аппаратуре. В 21 веке значительно усовершенствовалась  и техника визуализации объектов, в частности биологических. Это атомный силовой микроскоп. Рассмотреть индивидуальный атом — мечта, занимавшая ученых на протяжении десятилетий. Именно поэтому атомно-силовой микроскоп с момента его изобретения в 1986 году сотрудниками лаборатории IBM стал одним из важнейших инструментов химиков и материаловедов. Его работа основана на взаимодействии зонда (кантилевера) — гибко закрепленного и точно перемещаемого заостренного «щупа» — с поверхностью изучаемого образца. Атомно-силовой микроскоп фиксирует притяжение или отталкивание зонда, вызванное силами Ван дер Ваальса, что выгодно отличает прибор от конкурентов — сканирующего электронного (растрового) и сканирующего туннельного микроскопов. Последние также изучают поверхность материала с высокой точностью, однако растровый электронный микроскоп использует в качестве щупа пучок электронов, а туннельный фиксирует, как меняется величина туннельного тока между металлическим кантилевером и образцом. А там, где электричество, необходима проводимость: растровый и туннельный микроскопы могут работать только с проводящими объектами, оставляя без внимания огромную область — органическую химию, столь популярные сейчас углеродные материалы и биообъекты (рис. 2.2.-2.4).³⁹

Рис.2.2. Схематическое изображение магнитно-резонансного силового микроскопа. Образец (препарат вируса табачной мозаики) нанесен на кончик ультрачувствительного кремниевого  кантилевера, обращенный к магнитной  игле.

Рисунок 2.3. Полученные кадры, отснятые на разном расстоянии (A), и воссозданная на их основе трехмерная реконструкция образца (C, D, F, G). Изображение РЭМ того же самого региона (E).

Рис.2.4.А  вот такие изображения удавалось  получать ранее (вирус табачной мозаики, ПЭМ, оттенение Pt/C).

На этом достижении наука не остановилась, техника микроскопирования продолжает совершенствоваться. Недавно ученые продемонстрировали возможность заглянуть  внутрь клетки с помощью нового метода - сканирующей в ближнем поле ультразвуковой голографии - Scanning Near Field Ultrasound Holography (SNFUH) – этот революционный подход обеспечивает неинвазивное нано-разрешение для изображения глубоко проникающих частиц. Он дает возможность получить одновременную топографию и голографию с нанометровым разрешением, а также обеспечивает альтернативный способ изучения клетки в ее нормальном состоянии, без применения различных воздействий: помещения в вакуум, покрывания металлом, обстреливанием электронами и т.д. как это происходит в случае применения электронной микроскопии или флуоресцентных методов.

Метод SNFUH сочетает три различных подхода. Это уникальная комбинация сканирующей  зондовой микроскопии (которая обеспечивает отличное боковое и вертикальное разрешение), совмещенной с ультразвуковой детекцией (которая «просматривает»  структуру изнутри слой за слоем) и новый голографический подход (для улучшения разрешения по фазе).

Используя в качестве наночастиц одностеночные  углеродные наногорны (single-walled carbon nanohorns (SWCNHs)) диаметром 70-100 нм в in vivo эксперименте на мышах, с помощью SNFUH удалось визуализировать  частицы в жидкости клеток и в  крови, таким образом показав, что  наночастицы вызывают достаточное  рассеяние волн для визуализации их с помощью ультразвуковой голографии.

В получении  и обработке данных использовался  следующий принцип: если клетка колеблется с мегагарцевой частотой fs, определяемой пьезоэлектрическим кристаллом атомно-силового микроскопа, то ультразвук, проходящий через клетку, может немного влиять на положение кантилевера, находящегося в контакте с клеточной поверхностью, и в то же время водная среда клетки обеспечивает необходимые условия для распространения ультразвукового спектра. А когда кантилевер колеблется без прикосновения к клетке с собственной частотой fc, становится возможным вычислить параметры взаимодействия иглы и поверхности клетки. Такая детекция с использованием связи между двумя осцилляторами обеспечивает информацию о внутреннем состоянии клетки (рис. 2.5.).⁴⁰

Рис.2.5. Возможности различных инструментальных подходов в изображении мышиной  легочной ткани,подвергнутой воздействию  наночастиц в in vivo эксперименте; a-d: макрофаги контрольного образца без наночастиц, e-h: макрофаги из ткани, экспонированной с SWCNH в течение 7 дней; a,e – оптический метод; b,c,f,g – атомно-силовая микроскопия; d,h – метод ультразвуковой голографии SNFUH. Белые точки, некоторые из которых указаны зелеными стрелками, соответствуют наночастицам, расположенным внутри клеток.  
 
 
 
 
 
 
 
 

Заключение

Изучив  большое количество литературы и  интернет - источников по методам исследования эндокринной системы в норме  и патологии, в курсовой работе мною были изложены основные из них, некоторые  описаны, также дана характеристика новейших методов, которые ещё широко не применяются или находятся  в стадии доработки. На примере щитовидной железы были систематизированы методы, использующиеся для исследования в  тератологии. Дан краткий обзор  истории изучения эндокринологии.

Помимо  описанных мною в данной работе методов  исследования эндокринной системы  в норме и патологии, существуют и другие, менее применяемые, но, безусловно заслужившие рассмотрения. К сожалению, в своей курсовой работе, ограниченной по объёму, невозможно рассмотреть все методы исследования самой загадочной, и, пожалуй, самой  интересной системы организма, но всё  же  думаю, что в своей работе, я смог охарактеризовать тему, и раскрыть её в достаточном объёме, поэтому поставленные цель и задачи считаю выполненными. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  использованной литературы

1. Абдувалиев А. А., Гильдиева М. С., Хидиров Б. Н., Сайдалиева М., Саатов Т. С. Компьютерное моделирование регуляторики щитовидной железы в норме и при новообразованиях. Клиническая лабораторная диагностика №7, 2010.
2. Альдо Пинкера, Михель Мариньо, Эмилио Фиорэ, Исследование антител к щитовидной железе в клинической практике., Журнал «Клиническая лабораторная диагностика», М., Медицина, №9, 2008.
3. Бахметьев Б.А. Ширшев С.В. Красных М.С. Влияние экзогенного тироксина на различные типы иммунного ответа в эксперименте // Докл. Академии Наук. 2003. Т. 390 № 5. С. 706-708.
4. Биохимия гормонов и гормональной регуляции, М., 1976.
5. Гарбуз Н. А., Дрыгина Л. Б., Калинина Н. М.,  Исследование уровней антитиреоидных антител у пациентов с диффузным токсическим зобом и эндокринной офтальмопатией , Санкт-Петербург, 2000.
6. Герасимов Г.А., Петунина Н.А., Павлова Т.Л., Трухина Л.В. Роль антител к рецептору тиреотропного гормона в диагностике и прогнозе лечения диффузного токсического зоба и эндокринной офтальмопатии // Проблемы эндокринологии. 2001. Т. 47. № 4. С. 31–33.
7. Дедов И. И., Мельниченко Г. А., Фадеев В. Ф., Эндокринология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 432с.
8. Дедов И. И., Трошина Е. А., Александрова Г. Ф., Диагностика, лечение и профилактика узловых форм заболеваний щитовидной железы, М., 1999.
9. Заплатников К., Менцель К., Диль М., Дёберт Н.,  Хамшо Н. , Грюнвальд Ф. Кафедра радиоизотопной медицины университетской клиники им. И.-В.Гёте г. Франкфурт на Майне ФРГ, Позитронно-эмиссионная томография с 18F-фтордезоксиглюкозой в ракурсе современной диагностики, диспансерного наблюдения и лечения дифференцированного рака щитовидной железы, М., Журнал «Кардиология», Бионика, Т.45, №2, с.90 – 99, 2005.
10. Карцова А.А. , Жидкостная хроматография в медицине, М.: ХИМИЯ, 2000.
11. Калмыков В. Л., Оптимизация экстракционного флуориметрического метода количественного определения катехоламинов и серотонина в головном мозге крыс и использование его в исследованиях функциональной роли этих соединений: ил РГБ ОД 61:85-3/1199, дисс. на соиск. уч. Степени к.м.н., 2000.
12. Курзанцева О. М., Мурашковский А. Л., Евменова Т. Д., Шайдулина О. Г., Чиркин Н. И., Давыдов Е. В. Опыт применения комплексного ультразвукового исследования с использованием цветного доплеровского картирования в диагностике и дифференциальной диагностике очаговых образований щитовидной железы, Медицинский журнал "SonoAce-Ultrasound" N14, 2006.
13. Махортов В. Г. Методология измерения биологических взаимодействий на основе поверхностного плазмонного резонанса, 2007.
14. Потемкин В.В. Эндокринология. – М.: Медицина, 1999. – 640 с.
15. Потехин О.Е., История открытия современных методов молекулярной диагностики. Архив газеты «Новости А/О Юнимед», 2009.
16. Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г., Карцова А.А. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: Изд-во С.-Петербург. ун-та, 1998. 610c.
17. Теппермен Дж., Теппермен Х., Физиология обмена веществ и эндокринной системы. – М.:Мир, 1989. – 656с.
18. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа. – М. - Мир. - 1991.
19. Тучин В. В. Оптическая биомедицинская диагностика. — М., Физматлит, 2007.