Методы исследования эндокринной системы в норме и патологии

11. Иммунологические  методы.

К иммунологическим методам в первую очередь относят иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА — метод выявления антигенов или антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет:

• предварительной фиксации антигена или антитела на подложке;
• добавления исследуемого образца и связывание фиксированных антигена или антитела с антигеном-мишенью или антителом-мишенью;
• последующего добавления антигена или антитела, меченного ферментативной меткой с ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску под действием фермента. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.Определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов проводят в сравнении с контрольными пробами.

До появления  методов ИФА диагностика заболеваний  щитовидной железы строилась на анализе  клинической картины, которая далеко не всегда четко отражает развитие патологии и проявляется на достаточно поздних ее этапах. Сегодня методы ИФА являются основными для выявления  отклонений в функции щитовидной железы, постановке дифференциального  диагноза и осуществления контроля за проводимым лечением. ¹⁹

Исследование  уровней антитиреоидных антител – иммунохемилюминесцентный метод. Исследована распространенность антител к антигенам ткани щитовидной железы: тиреоглобулину, тиреоидной пероксидазе и рецептору ТТГ у пациентов с диффузным токсическим зобом и эндокринной офтальмопатией. При обследовании у таких пациентов отмечается высокий уровень антител к рецептору ТТГ, который снижается на фоне тиреостатической терапии.²⁰ Показано, что определение антител к рецептору ТТГ и тиреоглобулину должно служить дополнительным диагностическим критерием при обследовании.²¹

Методы  определения антител к рецептору  ТТГ:

1. Определение  TBII

1.1. Радиорецепторный  метод 

1.1.1. С  использованием свиного рТТГ (TRAK)

1.1.2. C использованием  человеческого рТТГ, экспрессированного  СНО-клетками (СНО-R)

1.1.3. С  использованием рТТГ, экспрессированного  лейкемическими летками (K562)

1.2. FACS

1.3. Иммунопреципитация 

2. Биологические  методы определения стимулирующих  (TSAb) и блокирующих (TBAb) антител 

2.1. Оценка  продукции цАМФ (определяется с  помощью РИА) 

2.1.1. в  FRTL-5 клетках 

2.1.2. в  CHO-R клетках 

2.2. CHO-R клетки, в которые введен ген  цАМФ-зависимой люциферазы.

В общем  и целом, можно выделить два принципиально  отличающихся метода определения уровня АТ-рТТГ:

1. Радиорецепторный  анализ, основанный на подавлении  антителами связывания радиоактивного  ТТГ (125I-ТТГ) с его рецептором (TBII);

2. Биологические  методы in vitro, при которых используются  культуры тироцитов, где после  воздействия АТ-рТТГ сыворотки  пациента определяется повышение  уровня цАМФ в случае стимулирующих  антител или блокада продукции  цАМФ, индуцированная ТТГ, в случае  блокирующих антител. 

Другие  методы, такие как FACS или иммунопреципитация до настоящего времени остаются экспериментальными.²²  

12. ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография с ¹⁸F фтордезоксиглюкозой).²³

¹⁸F-ФДГ-ПЭТ, одна из разновидностей радионуклидных методов исследования, позволяющая определить повышенный обмен глюкозы в клетках с неопластической активностью, в последнее время заняла прочное место среди других методов диагностики злокачественных заболеваний. Данное исследование позволяет не только количественно измерять уровень опухолевого метаболизма, но и визуализировать очаг опухоли в трехмерном изображении (подобно компьютерной томографии). Это открывает новые возможности как в диагностике, так и в контроле за лечением. К одной из областей, где применяется ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ, относятся неопластические заболевания ЩЖ, в частности их дифференцированные злокачественные опухоли. Этот метод особенно важен при опухолях, которые не накапливают радиоактивный ¹³¹I (либо при слабом его накоплении), у больных с повышенным уровнем тиреоглобулина (ТГ), который в сочетании с определением уровня ТГ на фоне эндогенной или экзогенной стимуляции ТТГ в динамике является единственным опухолевым маркером при ДРЩЖ.

13. Генетические методы и ДНК – диагностика (ПЦР).

Для выявления  причин заболеваемости и установления связи заболеваний щитовидной железы иногда используют и обще-генетические методы, например такие, как популяционно-статистический и близнецовый метод. Например, любопытно  такое исследование, как установление связи между курением и заболеваниями  щитовидной железы. В исследование были включены 132 пары близнецов одного и того же пола (264 человека) из национального  регистра близнецов, которые согласно анкетированию имели те или иные заболевания щитовидной железы. Курение  оказалось ассоциировано с повышенным риском заболеваний щитовидной железы. Эта ассоциация оказалась статистически достоверна как у моно-, так и у дизиготных близнецов. Причем эффект курения на риск развития заболеваний щитовидной железы для монозиготных близнецов оказался более значимым. Аналогичные результаты были получены при разделении пациентов, на имевших аутоиммунные и прочие заболевания щитовидной железы. В парах, где курили оба близнеца, аутоиммунное заболевание щитовидной железы с большей вероятностью имел тот близнец, который выкуривал больше. Аналогичной зависимости для неаутоиммунных заболеваний щитовидной железы выявлено не было.²⁴

Молекулярно-генетические методы широко применяются для изучения наследственных заболеваний щитовидной железы. Например, изучение мутаций генов (изучение мутации в гене к рецептору ТТГ у больных с тиреотоксическими аденомами щитовидной железы).²⁵ В данном случае применялась ПЦР - диагностика. Молекулярно – генетические методы используются и для выявления наследственной формы рака щитовидной железы. Синдромы, включающие рак щитовидной железы (МЭН2А и МЭН2В), характеризуются возникновением феохромоцитом. Для МЭН2А характерны также гиперплазия или аденома паращитовидных желез, для МЭН2В – аномалии развития скелета. Наличие мутации в гене RET свидетельствует о риске рака щитовидной железы, достигающем 90–100%.

14. Скрининговые исследования.

Скрининговые  исследования проводятся с целью  первичной диагностики заболеваний. Американская тиреоидологическая ассоциация рекомендует скриниговое (то есть без особых показаний у лиц без каких-либо клинических проявлений) проведение определение уровня ТТГ с целью оценки функции щитовидной железы каждые 5 лет, начиная с возраста 35 лет. В первую очередь эта рекомендация относится к женщинам, распространенность нарушения функции щитовидной железы у которых встречаются почти в 10 раз чаще, чем у мужчин.²⁶

15. Компьютерное моделирование.

Существующие  биологические экспериментальные  данные и теоретические положения  о структурно-функциональной организации  щитовидной железы на клеточном уровне позволяют строить математические модели для количественного анализа  регуляторики численности клеточного сообщества фолликула щитовидной железы в норме и при аномалиях  на основе метода моделирования регуляторных механизмов живых систем и уравнений  регуляторики клеточных сообществ.²⁷

16. Экспериментальное  моделирование.

В настоящее  время для изучения патологий  эндокринных желёз используются и экспериментальные методы –  создание заболевания у подопытных животных и дальнейшее изучение вызванного заболевания.  Гипертиреоз экспериментальный — тиреотоксикоз, вызванный у подопытного животного введением гормонов щитовидной железы. Так, например, были изучены различные типы иммунного ответа при гипертиреозе. Эксперимент проведен на мышах-самцах породы SWISS массой 20-22 г. Животные были разделены на 2 группы, одна из которых являлась контрольной, а другой вводили гормон в концентрации 4 мкг/кг, который формирует состояние умеренного гипертиреоза. В первой серии экспериментов инъекции Т4 проводили в течение 10 дней на протяжении антигеннезависимого и антигензависимого этапов. На 5-е сутки введения Т4 животных внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ). На 9-е сутки от начала эксперимента в стопу мыши вводили разрешающую дозу антигена (АГ). Во второй серии (антигеннезависимый этап развития первичного иммунного ответа) инъекции Т4 проводили в течение 5 дней до антигенного воздействия и в последний день введения Т4 животных иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ. На 9-е сутки от начала эксперимента проводили повторную иммунизацию ЭБ в стопу. В третьей серии (антигензависимый период развития первичного иммунного ответа) инъекции Т4 начинали после внутрибрюшинной иммунизации и проводили в течение 6 дней. Разрешающую дозу АГ вводили в стопу мыши на 4-ый день после первой иммунизации. Влияние гормона на гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (методом локального гемолиза в геле) и по степени утолщения стопы в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) соответственно. Таким образом, было выяснено, что в условиях одновременной индукции клеточно-опосредованных и гуморальных иммунных реакций тироксин оказывает стимулирующее влияние на формирование провоспалительных реакций. По-видимому, такое действие Т4 опосредуется через Тh1.²⁸  
 
 
 
 
 
 
 
 

2. Проблемы и перспективы методов исследования эндокринной системы

Медицинские и биологические достижения последних лет открыли перед клиницистами и исследователями новые диагностические и исследовательские возможности, позволяющие достаточно быстро и точно проводить дифференциальную диагностику между различными заболеваниями, а также изучать физиологию и биохимию эндокринной системы. Разработка новых методов исследования является актуальным для различных областей медицины и биологии. На сегодняшний день в распоряжении исследователя имеется широкий спектр специальных инструментальных и лабораторных методов, помогающих изучить эндокринную систему, но в то же время многие вопросы физиологии, биохимии и эндокринной патологии остаются открытыми. Так, например, для некоторых пептидных гормонов (инсулина, пролактина, соматотропина) механизм действия еще не расшифрован до конца, но, по-видимому, они также, как гормоны щитовидной железы взаимодействуют с рецепторами, находящимися на клеточной поверхности, вызывая образование посредников.

Большое значение для исследования гормонов играют последние достижения генетики и молекулярно-генетических методов. Разработаны способы получения  некоторых пептидных гормонов (например, инсулина и соматотропина) с использованием генной инженерии. Метод основан на выделении гена соответствующего гормона и включении его в геном бактериальных клеток, приобретающих способность к синтезу данного гормона. В результате размножения образуются большие массы бактерий, активно синтезирующих гормоны.

Концентрация гормонов в крови и тканях очень мала (10^-6-10^-10 М), поэтому для их определения требуются высокочувствительные методы. Широко используются радиолигандные методы, основанные на конкурентном связывании меченого и немеченого гормонов с различными белками: антителами, транспортными белками (например, связывание кортизола, прогестерона и половых гормонов с соответствующими транспортными белками крови) или рецепторами (например, связывание адренокортикотропина с мембранами надпочечников и лютеинизирующего гормона с мембранами семенников крыс). Для анализа небелковых гормонов применяют химические методы, например, стероидные гормоны и адреналин определяют флуорометрическим и колориметрическим методами. Для количественного определения пептидных гормонов наряду с радиолигандными широко применяются биологические методы, основанные на характерных для каждого гормона биологических эффектах. Например, содержание лютеинизирующего гормона устанавливают по увеличению массы яичников у гипофизэктомированных крыс или по снижению в них содержания аскорбиновой кислоты.

Благодаря достижениям экспериментальной  физиологии, биохимии белков, и гормонов, в частности, медицине открывается  новый взгляд на проблемы метаболизма  и регуляции функций организма. Так, в новом свете стал рассматриваться  метаболический синдром. Метаболический синдром (МС) определяется как комплекс метаболических, гормональных и клинических нарушений, в основе которых лежит инсулинорезистентность (ИР) и компенсаторная гиперинсулинемия (ГИ). МС является в настоящее время одной из приоритетных проблем медицины. Выделение метаболического синдрома (МС) имеет большое значение, поскольку это состояние лежит в основе сахарного диабета 2-го типа (СД 2), эссенциальной гипертензии, атеросклероза. По современным представлениям система регуляции количества жировой массы, как и любая другая гомеостатическая система, включает в себя центральное и периферическое звенья. Периферическое звено регуляции представлено гормоном, вырабатываемым жировыми клетками - лептином. Основная его роль - это обеспечение афферентной сигнализации в ЦНС о количестве жировой ткани. Кроме лептина, выделены и другие маркеры метаболического синдрома, раннее неизвестные науке: апелин, висфатин, обестатин, преадипоцитарный фактор 1 (Pref-1), несфатин, чемерин,  пропротеин конвертаза-9 (PCSK9), рецептор конечных продуктов гликкозилирования (RAGE).²⁹ Данные вещества были выделены методом иммунохимического анализа, который сейчас может быть осуществлён на автоматизированных анализаторах «Биохиммак».

Проблемы  выделения и очистки многих гормонов остаются и сейчас. Многие из таких  вопросов решаются путём изменения  и совершенствования раннее использовавшихся методик. Так, для выделения биогенных  аминов (катехоламинов и серотонина), использовался экстракционный флуоримет-рический метод. Этот метод сочетает выделение биогенных аминов экстракцией органическими растворителями и их последующее флуориметрическое определение, но он наиболее приемлем для массового комплексного анализа в биологических образцах, благодаря уникальному сочетанию высокой скорости анализа, возможности параллельного анализа большого числа проб, простоте и удобству выполнения процедур. Наряду со всеми перечисленными достоинствами, существенным недостатком экстракционного флуориметрического метода определения биогенных аминов являются значительные потери последних при экстракционной очистке. После проведённых исследований метод был модифицирован (впервые в практику биохимического анализа внедрены автоматические дозаторы системы "СІПАВ", благодаря оптимизации экстракционных процедур извлечения из ткани и очистки биогенных аминов, химических процедур получения их флуорофоров и операций измерения флуоресценции предложено шесть новых высокоэффективных вариантов экстракционного флуориметрического метода определения в ткани головного мозга крыс норадреналина, дофамина и серотонина) и введён в практику.³⁰ За последние годы также были модифицированы и введены в практику тонкослойный метод определения альдостерона в моче (Анастасьина Г.В.), метод определения биогенных аминов в биологических жидкостях на ионообменных смолах (Герасимова Ц.И.).³¹