Методы исследования эндокринной системы в норме и патологии

При изучении функционального состояния эндокринных  желёз используются следующие методические подходы:

1. Определение  исходного уровня того или  иного гормона.

2. Определение  уровня гормона в динамике  с учётом циркадного ритма  секреции.

3. Определение  уровня гормона в условиях  функциональной пробы.

4. Определение  уровня метаболита гормона. 
 
 
 
 
 
 

Таблица 1. Патогенез эндокринных заболеваний⁷

Наиболее  часто в клинической практике используется определение базального уровня того или иного гормона. Обычно кровь берётся натощак утром, хотя приём пищи не отражается на продукции  многих гормонов. Для оценки деятельности многих эндокринных желёз (щитовидной, паращитовидных) оценки базального уровня гормонов вполне достаточно. При определении  базального уровня гормона определённые сложности могут возникнуть в  связи с циркуляцией в крови  нескольких молекулярных форм одного и того же гормона. В первую очередь  это касается паратгормона.

Большинство гормонов циркулирует в крови  в связанном состоянии с белками-переносчиками. Как правило, уровень свободного, биологически активного гормона  в крови в десятки или сотни  раз ниже, чем общий уровень  гормона.

Уровни  большинства гормонов имеют характерную  суточную динамики (циркадианный ритм секреции), при этом очень часто  это динамика приобретает клиническое  значение. Наиболее важна и иллюстративна  в этом плане динамика продукции  кортизола (рис. 1.1).⁸

Другими примерами в этом плане являются пролактин и гормон роста, ритм секреции которых также определяется циклом «сон-бодрствование». В основе патогенеза ряда эндокринных заболеваний лежит  нарушение суточного ритма продукции  гормона.

Помимо  циркадианного ритма, на уровне гормона  в крови может отражаться большинство  биологических параметров. Для многих гормонов референтные показатели в значительной мере зависят от возраста (рис. 1.2)⁹, пола, фазы менструального цикла.

На уровень  ряда гормонов могут оказывать влияние  не только сопутствующие соматические заболевания и принимаемые по поводу них лекарственные препараты, но и такие факторы как стресс (кортизол, адреналин), особенности экологии (уровень тироксина в регионах с разным потреблением йода), состав принимаемой накануне пищи (С-пептид) и многие другие.

Основополагающим  принципом оценки деятельности гипофиз-зависимых (щитовидная железа, кора надпочечников, гонады) и ряда других эндокринных желёз является определение так называемых диагностических пар гормонов. В большинстве случаев продукция гормона регулируется механизмом отрицательной обратной связи. Обратная связь может иметь место между гормонами, принадлежащими к одной системе (кортизол и АКТГ), или между гормонами и его биологическим эффектором (паратгормон и кальций). Кроме того, между гормонами, составляющими пару, не обязательно должно существовать прямое взаимодействие. Иногда оно опосредовано другими гуморальными факторами, электролитами и физиологическими параметрами (объем почечного кровотока, уровень калия и ангиотензин для пары ренин-альдостерон). Изолированная оценка показателей, составляющих пару, может стать причиной ошибочного заключения.

Несмотря  на улучшение методов гормонального  анализа, функциональные пробы и  сегодня имеют большое диагностическое  значение в диагностике эндокринопатий. Функциональные пробы подразделяются на стимуляционные и супрессивные (подавляющие). Общий принцип проведения проб заключается в том, что стимуляционные пробы назначаются при подозрении на недостаточность эндокринной железы, а супрессивные – при подозрении на её гиперфункцию.

Наряду  с оценкой уровня гормонов в крови  определённое диагностическое значение в ряде случае случаев может иметь  определение их экскреции с мочой. Диагностическая ценность этих исследований, например определение экскреции  свободного кортизола, существенно меньше таковой для современных функциональных тестов. Аналогичным образом в настоящее время практически полность перестали использовать определение экскреции метаболитов гормонов, единственным исключением является определение уровня метаболитов катехоламинов для диагностики феохромоцитомы.

В последние  годы широкое распространение получили полностью автоматизированные методы гормонального исследования, что  позволяет снизить число таких ошибок, как неправильное взятие крови, хранение, доставка и другие «человеческие факторы».

Из  инструментальных методов исследования наиболее часто используют ультразвуковое исследование (УЗИ), рентгенографию, компьютерную томографию (КТ), и магнитно-резонансную томографию (МРТ). Кроме того, в эндокринологии применяют специальные методы: ангиографию с селективным забором крови, оттекающей от эндокринной железы, радиоизотопное исследование (сцинтиграфия щитовидной железы), денситометрия костей. Основные инструментальные методы, использующиеся для изучения эндокринных желёз представлены в таблице 2.

Молекулярно-генетические методы исследования.

Бурное  развитие науки за последние несколько десятилетий и исследования в области молекулярной биологии, медицинской генетики, биохимии, биофизики, тесно смыкающиеся с микробиологией, иммунологией, онкологией, эпидемиологией и т.д., привели к созданию и активному внедрению в практику диагностических лабораторий молекулярно-биологических методов исследований генома человека, животных, растений, бактерий и вирусов. Эти методы чаще всего называют ДНК-исследованиями.

Методы  ДНК-исследований позволяют осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии. Активное развитие методов ДНК-диагностики и внедрение их в практику позволяют предположить, что недалек тот момент, когда эти методы значительно сузят круг задач более традиционных диагностических исследований, какими являются методы цитогенетики, а может, и вытеснят их из практической медицины в научную сферу. 

Таблица 2. Основные инструментальные методы

 исследования  эндокринных      желёз¹⁰

В настоящее  время имеется два направления  ДНК-диагностики: гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и диагностика с использованием полимеразной цепной реакции.

ПЦР сразу  же была внедрена в практику, что  позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. Метод стал настолько популярен, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п. н.) требовалась неделя, то современные автоматические секвенаторы позволяют определять до 5000 п. н. в сутки. Это, в свою очередь, способствует значительному росту баз данных, содержащих информацию о последовательностях нуклеотидов в ДНК. В настоящее время предложены всевозможные модификации ПЦР, описаны десятки различных применений метода в том числе «лонг-ПЦР», позволяющая копировать сверхдлинные последовательности ДНК. За открытие ПЦР К. В. Mullis в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Все подходы  к генодиагностике могут быть выделены в несколько основных групп:

1. Методы  идентификации определенных участков ДНК.

2. Методы  определения  первичной  последовательности нуклеотидов в ДНК.

3. Методы  определения содержания ДНК и  анализа клеточного цикла.¹¹

ПЦР позволяет  найти в исследуемом материале  небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической  последовательности нуклеотидов ДНК  любого организма среди огромного  количества других участков ДНК и  многократно размножить его. ПЦР  – это "in vitro" аналог биохимической  реакции синтеза ДНК в клетке.

ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции.

Результатом открытия ПЦР стало немедленное  практическое использование метода. В 1985 г. была опубликована статья, в  которой была описана тест-система  для диагностики серповидно-клеточной  анемии на основе ПЦР. Начиная с 1986 г. К настоящему времени ПЦР посвящено более 10000 научных публикаций. Перспективы использования ПЦР представляются более чем впечатляющими.¹²

Цитохимические  методы исследования.

Эти методы представляют собой варианты описанных  биологических исследований in vitro. Они  обычно обладают большей чувствительностью, чем радиоиммунологические методы, но значительно более громоздки  и дороги при расчете на одно определение. Результаты цитохимических биологических  исследований количественно оценивают  на гистологических срезах с помощью  специального устройства — микроденситометра. 
Гистологические срезы готовят из специфических для данного гормона тканей или клетокмишеней, до того подвергшихся воздействию разных концентраций стандартного и испытуемого гормона. С помощью денситометра сканируют область диаметром  250 — 300 нм для количественной оценки цветной реакции, обусловленной изменением редокссостояния объекта под влиянием гормональной стимуляции. Для количественного анализа используют гистологические красители, чувствительные к этим изменениям.

Первая  система цитохимического биологического исследования была разработана для  АКТГ, и тканьюмишенью в этой системе  служила кора надпочечников. Другие способы биологического определения  АКТГ либо слишком малочувствительны, либо требуют больших объемов  плазмы. Таким образом, цитохимическое определение редокс-состояния ткани  является ценным средством анализа  нормальной и измененной функции  системы гипоталамус—гипофиз—надпочечники по уровню АКТГ. 
Разработан цитохимический метод определения и ЛГ, но при этом встретились существенные трудности, связанные со значительными колебаниями результатов разных определений и непостоянной чувствительностью объекта, что, возможно, отражает известные биологические расхождения у разных животных. Чувствительные специфические цитохимические методы предложены для определения паратгормона, АДГ и тиротропина.

При дальнейшем усложнении оборудования, которое позволит увеличить число исследований в  одном определении, этот метод может  найти более широкое применение. Он особенно привлекателен потому, что не требует использования  радиоактивных соединений. Цитохимические методы нешироко применяются в клинике  и используются в основном в качестве чувствительного способа в научных  исследованиях.¹³ 
 

1.3. Современные методы  исследования эндокринной  системы на примере  исследования щитовидной  железы

В своей  работе, ограниченной по объёму, современные методы исследования эндокринной системы в норме и патологии, я рассмотрю на примере исследования эндокринной железы, что актуально, в связи с большим распространением заболеваний щитовидной железы в республике Башкортостан.

1. Ультразвуковое исследование.

УЗИ позволяет  верифицировать достаточно субъективные данные пальпации. Оптимальными для  исследования служат датчики с частотой 7,5 Мгц и 10 Мгц. В настоящее время  используется цветное доплеровское картирование, что позволяет визуализировать  мелкие сосуды в щитовидной железе и дает информацию о направлении  и средней скорости потока. Возможности  метода зависят от опыта и квалификации специалиста, проводящего исследование. Принцип метода заключается в том, что ультразвук, посылаемый частыми импульсами, проникает в органы человека, отражается на границе раздела сред с различным ультразвуковым сопротивлением, воспринимается прибором и воспроизводится на экране и ультрафиолетовой бумаге. Метод безвреден и противопоказаний не имеет (рис.1.3).