Лабораторная диагностика инфекционных болезней

Реакцию гемаглютинації застосовують для діагностики як бактеріальних (черевний тиф, паратифи, дизентерія, бруцельоз, чума, холера й ін.), так і вірусних (грип, аденовірусні інфекції, кір й ін.) інфекцій. По чутливості й специфічності РНГА перевершує РА.

   Реакцію гальмування гемаглютинації (РГГА) використовують для титрування противірусних антитіл у сироватках крові, а також з метою встановлення типової приналежності виділених вірусних культур. РГГА можна застосувати для діагностики тих вірусних інфекцій, збудники яких володіють гемаглютинуючими властивостями.

Принцип методу полягає в тому, що сироватка, що містить антитіла до конкретного типу вірусу, придушує його гемаглютинуючу активність й еритроцити залишаються неаглютинірованими.

   Реакція гальмування (затримки) пасивної гемаглютинації (РГПГА). У РГПГА беруть участь три компоненти: імунна сироватка, антиген (досліджуваний матеріал) і сенсибілізовані еритроцити.

Якщо в досліджуваному матеріалі є антиген, що специфічно реагує з антитілами імунної стандартної сироватки, то він зв'язує їх, і при наступному додаванні еритроцитів, сенсибілізованих антигеном, гомологічним сироватці, гемаглютинація не наступає.

РГПГА застосовують для виявлення мікробних антигенів, для кількісного їхнього визначення, а також для контролю специфічності РПГА.

   Реакція латекс аглютинації (РЛА). Як носій антитіл (імуноглобулінів) використовують частки латексу. РЛА є експрес-методом діагностики інфекційних хвороб, з огляду на час проведення (до 10 хв) і можливість виявити антиген у невеликому обсязі досліджуваного матеріалу.

РЛА застосовують для індикації антигенів Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типу b, Neisseria meningitidis у цереброспінальної рідини, виявлення стрептококів групи А в мазках із зіва, для діагностики сальмонельозу, іерсініозів й інших захворювань. Чутливість методу становить 1—10 г/мл, або 103—106 бактеріальних кліток в 1 мкл.

   Реакція коаглютинації (Ркоа) заснована на здатності білка А стафілококів приєднувати специфічні імуноглобуліни. РКА - метод експрес-діагностики - служить для виявлення розчинних термостабільних антигенів у секретах людини й у складі циркулюючих імунних комплексів (ЦІК). Виявлення специфічних антигенів у складі ЦІК вимагає їхнього попереднього осадження із сироватки крові.

   Реакція преципітації. У реакції преципітації (РП) у результаті взаємодії антитіл з високодисперсними розчинними антигенами (білки, полісахариди) утворяться комплекси за участю комплементу - преципітати. Це чутливий тест, використовуваний для виявлення й характеристики різноманітних антигенів й антитіл. Найпростішим прикладом якісної РП є утворення непрозорої смуги преципітації в пробірці на границі нашарування антигену на імунну сироватку - реакція кольцепреципітації. Широко застосовують різні різновиди РП у напіврідких гелях агару або агарози (метод подвійний імунодифузії, метод радіальної імунодифузії, імуноэлектрофорез).

   Реакція зв'язування комплементу (РЗК) заснована на феномені гемолізу за участю комплементу, тобто здатна виявляти тільки комплементзвязуючі антитіла.

РЗК широко застосовують для діагностики багатьох бактеріальних і вірусних інфекцій, рікетсіозів, хламідіозів, інфекційного мононуклеозу, протозойних інфекцій, гельмінтозів. РЗК є складною серологічною реакцією, у якій беруть участь дві системи: досліджувана (сироватка крові), представлена системою антиген - антитіло й комплементом, і гемолітична (еритроцити барана + гемолітична сироватка). Гемолітична сироватка являє собою інактивовану прогріванням сироватку крові кролика, імунізованого еритроцитами барана. Вона містить антитіла проти еритроцитів барана.

Позитивний результат РЗК - відсутність гемолізу - спостерігають у випадку, якщо в досліджуваній сироватці втримуються антитіла, гомологічні антигену. При цьому комплекс, що утворився, антиген - антитіло зв'язує комплемент, а у відсутності вільного комплементу додавання гемолітичної системи не супроводжується гемолізом. У випадку відсутності в сироватці антитіл, що відповідають антигенові утворення комплексу антиген - антитіло не відбувається, комплемент залишається вільним і сироватка викликає гемоліз еритроцитів, тобто наявність гемолізу - це негативний результат реакції.

2.7 Імунологічні методи із застосуванням хімічних міток

Імунологічні реакції, такі, як імунофлюоресценція, імуноферментний аналіз, радіоімунологічний аналіз, імунний блоттінг характеризується застосуванням різних способів детекції (виявлення) комплексу антиген - антитіло на основі хімічних або фізичних міток (флюоресцируючих речовин, ферментсубстратних взаємодій, що приводять до фарбування реакційної суміші, радіоактивних ізотопів), що має на меті досягнення більшої чутливості й специфічності аналізу в порівнянні із серологічними методами, заснованими на природних феноменах.

   Імунофлюоресцентний метод. Імунофлюоресценція (ІФ) являє собою люмінесценцію біологічного об'єкта в ультрафіолетовому спектрі під мікроскопом після його попередньої обробки специфічними антитілами, міченими флюорохромом. ІФ була розроблена Кунсом в 1942 р. і застосовується як метод експресдіагностики інфекційних хвороб. ІФ - універсальний імунохімічний метод, що сполучає досить точний морфологічний аналіз зі специфічністю імунологічних методів.

Люмінесцируючі сироватки одержують за допомогою хімічної реакції між специфічними антитілами імунної сироватки й флюоресцируючим барвником флюорохромом, у якості якого найчастіше використовують ізотіоционат флюоресцеїну. Такі мічені антитіла називають конюгатом. На практиці використовують флюорохроми, що має жовто-зелену, жовту й червону флюоресценцію.

Мічена флюорохромом сироватка утворить із антигеном комплекс антиген - антитіло, що стає доступним спостереженню під мікроскопом в ультрафіолетових променях, що збуджують світіння флюорохрому. Метод ІФ застосовують у різних модифікаціях, зокрема використовують прямий і непрямий варіанти.

Метод прямої ІФ (синоніми: реакція імунофлюоресценції — РІФ, метод флюоресцируючих антитіл — МФА) використають тільки для визначення антигену: виявлення бактерій і рікетсій у мазках, виявлення вірусів у заражених клітинах, вивчення клітинних антигенів.

Прикладом застосування ІФ з метою виявлення вірусних антигенів є діагностика сказу у тварин. Мазки-відбитки мозку загиблих тварин обробляють люмінесцируючою антирабічною сироваткою. При позитивному результаті в цитоплазмі нейроцитів спостерігають глибки яскраво-зелених кольорів (тельця Бабеша-Негрі), що представляють собою скупчення вірусних нуклеокапсидів. На виявленні антигенів вірусів у мазках-відбитках зі слизової оболонки заснована експрес-діагностика грипу, парагрипу й аденовірусної інфекції.

Метод непрямої флюоресценції (реакція непрямої імунофлюоресценції — РНІФ) володіє рядом переваг у порівнянні з РІФ. Її використовують не тільки для визначення антигенів, але й для титрування антитіл; реакція має більшу чутливість, тому що дозволяє за допомогою однієї й тією же антивидовою міченою сироваткою виявити різні бактеріальні й вірусні антигени при застосуванні в кожному випадку на першому етапі постановки реакції немічених специфічних імунних сироваток. Визначення специфічних антитіл РНІФ є основним методом діагностики геморагічної лихоманки з нирковим синдромом, широко застосовується для діагностики захворювань, що передаються статевим шляхом.

2.8 Імуноферментний аналіз (ІФА)

Імуноферментний аналіз (ІФА) проводять у два етапи: перший — взаємодія антитіл з антигеном, другий — ферментативна індикація комплексу антиген — антитіло за рахунок появи фарбування реакційної суміші й реєстрації фарбування візуально або спектрофотометричним методом.

Існують два варіанти ІФА: твердофазний і рідкофазний, що розрізняються по способі поділи компонентів імунохімічної реакції. У порівнянні з описаними раніше методами виявлення антигенів й антитіл ІФА має істотні переваги:

—     високою чутливістю, що дозволяє визначати до 0,05 г/мл речовини;

—     можливістю використання мінімальних обсягів досліджуваного матеріалу (1-2 мкл);

—     можливістю інструментального або візуального обліку реакції;

—     експресністтю й можливістю автоматизації всіх етапів реакції.

ІФА в цей час широко використовують у практиці для діагностики багатьох інфекційних хвороб бактеріальної, грибкової етіології, протозойних інфекцій і гельмінтозів, але особливо вірусних інфекцій, зокрема гепатитів А, В, С, D, Е, G, Віл-інфекції, герпесвірусних, ротавірусних, аденовірусних, астровірусних, парвовірусних й інших інфекцій.

2.9 Імунний блоттінг

Принцип методу імунного блоттінгу складається у виявленні антитіл до окремих антигенів збудника. За допомогою цього методу визначають антитіла до антигенів ВІЛ (глікопротеїнам оболонки вірусу, білкам серцевини й ферментам вірусу). Результати імунного блоттінгу оцінюють як позитивні, сумнівного й негативні залежно від кількісного і якісного набору виявлених антитіл.

Необхідно відзначити, що імунний блоттінг уступає по чутливості ІФА, у деяких випадках може реєструватися негативний результат при наявності Віл-інфекції у пацієнта. Однак можливість реєстрації ложнопозитивних результатів в ІФА при Віл-інфекції вимагає комплексного підходу в діагностиці Віл-інфекції з обліком, крім результатів імунологічних реакцій (ІФА, імунний блоттінг), епідеміологічних і клінічних даних.

2.10 Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Метод ПЛР був розроблений американським біохіміком Кері Мюллісом в 1983 р. на основі застосування відкритої їм термостабільної ДНК-полімерази (Tag-полімерази). Принцип методу складається в збільшенні в 106—108 разів числа копій специфічної ділянки ДНК збудника, каталізуючого in vitro ДНК-полімеразою в автоматичному режимі.

У штучних умовах відтворення процесу реплікації специфічного для певного виду або роду збудників ділянки генома можливо за умови знання його нуклеотидної послідовності. Застосування методів детекції продуктів реплікації таких ділянок (ампліконів) дозволяє констатувати наявність збудника в досліджуваній пробі.

Описане вище комплементарне добудовування ланцюгів починається тільки в певних стартових блоках, що представляють собою короткі двуніткові ділянки. При приєднанні таких блоків до специфічних ділянок ДНК процес синтезу нового ланцюга направляється тільки в обраній ділянці, а не по всій довжині ланцюга ДНК. Для створення стартових блоків у заданих ділянках ДНК використовують два олігонуклеотидні запали, які називають праймерами. Праймери комплементарні послідовностям ДНК на лівій і правій границях специфічного фрагмента й орієнтовані так, що добудовування нового ланцюга ДНК протікає тільки між ними.

До достоїнств методу ПЛР варто віднести:

—     високу чутливість, що дозволяє визначати 10-1000 клітин у пробі;

—     високу специфічність, оскільки в досліджуваному матеріалі виявляється унікальний для даного збудника фрагмент ДНК;

—     універсальність процедури виявлення різних збудників з однієї біопроби;

—              високу швидкість аналізу (4—4,5 г);

—              можливість діагностики не тільки гострих, але й латентних інфекцій.

ПЛР ефективна для діагностики важкокультивуємих, некультивєемих і персистуючих форм мікроорганізмів. Її використання доцільно для виявлення збудників з високою антигенною мінливістю й внутрішньоклітинними паразитами.

Застосування ПЛР ефективно для діагностики широкого спектра бактеріальних і вірусних інфекцій.

Останнім часом досить успішно реалізуються кількісні методи ПЛР-аналізу, що дозволяють визначити концентрацію збудника в матеріалі (мікробне або вірусне навантаження), наприклад оцінити реплікативну активність вірусу гепатиту В, чи ВІЛ.

Однак варто мати на увазі, що метод ПЛР має й свої обмеження, зокрема, для діагностики інфекцій, викликаних умовно-патогенною аутофлорою.

2.11 Гібридизація нуклеїнових кислот.

Гібридизація нуклеїнових кислот, як і ПЛР, дозволяє ідентифікувати збудника в пробі без попереднього виділення. Для проведення аналізу синтезують одноланцюгову ДНК- або РНК-зонд, комплементарний специфічним нуклеотидним послідовностям збудника. Зонд мітять радіонуклідом, ферментом або інший легко розпізнаваною міткою. Досліджуваний матеріал піддають обробці з метою лізису мікроорганізмів, що перебувають у біопробі, виділення й денатурації ДНК. Далі проводять інкубацію зонда з досліджуваним зразком і вимір кількості міченої ДНК, що вступила в гібридизацію із ДНК, що перебуває в досліджуваній пробі. Реакція може відбуватися як на твердофазних сорбентах, так й у розчині, однак обов'язковою умовою є відмивання кількостей, що не зв'язалися, міченого зонда. Чутливість методу гібридизації нуклеїнових кислот уступає таки ПЛР і становить 103 мікробних клітин у пробі.

2

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1.              Дифференциальная диагностика заболеваний кожных болезней/Под ред. А. А. Студницина.—М.: Медицина, 1983.—560 с.

2. Дунаевский О.А. Дифференциальная диагностика заболеваний печени.— Л.: Медицина, 1985.—264 с.

3. Казанцев А. П., Матковский В. С. Справочник по инфекционным болезним.— М.: Медицина.-1985.—320 с.

4. Клиническая оценка лабораторных тестов//Под ред. Н. У. Тица.— М.:Медицина, 1986.— 480 с.

5.И., Кортев А. И., Дроздов В. Н. и др. Интенсивная терапия при инфекционных заболеваниях/ЦНИИ эпидемиологии  м-ва здравоохранения СССР и др.— М.;Кемерово:Б. и., 1986.- 94 с.