Лабораторная диагностика инфекционных болезней

Поряд з одержанням кормових дріжджів важливе значення для кормовиробництва мають також бактеріальні білкові концентрати зі змістом сирого білка 60-80% від сухої маси. Тут як сировина використовуються газоподібні продукти, що містять метан.

1.5. Підготовка біореакторів до посіву й вирощування мікроорганізмів

При культивуванні мікроорганізмів найчастіше застосовується спосіб глибинного вирощування в спеціальних апаратах - ферментерах.

В простерилізований термічним способом ферментер подається заздалегідь здрібнена, охолоджена й вистояні сировина, що у даному ферментерному цеху піддасться кислотному гідролізу при підвищеному тиску й температурі, у результаті чого 60-65% містких в них полісахаридів гідролізуються до моносахаридів.

Ферментер для вирощування дріжджів і бактеріальних клітин у рідкому живильному середовищі представлене на рис 1.

Рис. 1. Ферментер для вирощування мікроорганізмів у рідкому живильному середовищі.

/ — корпус ферментера; 2 — охолоджувальна сорочка; 3 — теплообмінник; 4 — подача холодної води в теплообмінник; 5 — висновок теплої води з теплообмінника; 6 — подача посівної культури; 7 — подача рідкого живильного середовища 8 — подача повітря для аерації й перемішування живильного середовища 9 — кювету для напрямку потоку повітря у внутрішню порожнину теплообмінника; 10 — вихід мікробної суспензії по закінченні ферментації; 11 — вихід повітря в атмосферу через очисний фільт.

Представлений вище ферментер забезпечує режим постійного перемішування суспензії мікробних клітин у рідкому живильному середовище й оптимальні умови аерації. З метою підтримки заданого температурного режиму в конструкції ферментера передбачається система відводу надлишкового тепла.

Робочий цикл вирощування культури мікроорганізмів триває близько 20 годин. Наприклад, при оптимальних умовах з 1 т відходів хвойної деревини можна одержати 200 кг кормових дріжджів. По закінченні робочого циклу культуральна рідина разом із суспендированими в ній клітинами мікроорганізмів виводиться з ферментера, а в нього знову подається живильний субстрат і культура дріжджових або бактеріальних клітин для вирощування.

Виведена з ферментера суспензія далі подається на флотаційну установку, за допомогою якої виробляється відділення біомаси від культуральної рідини. Після відстоювання мікробна маса концентрується за допомогою сепаратора.

Для досягнення кращої перетравлення дріжджів і бактеріальних клітин в організмі тварин проводиться спеціальна обробка мікробних клітин (механічна, ультразвукова, термічна, ферментативна), що забезпечує руйнування їхніх клітинних оболонок. Потім мікробна маса упарюється до необхідної концентрації й висушується до вологості 8-10%.

В отриманій сухій дріжджовій масі втримується 40-60% сирого білка, 25-30% засвоюваних вуглеводів, 3-5% сирого жиру, 6-7% клітковини й зольних речовин, а також велика кількість вітамінів (до 50 мг%). За допомогою обробки дріжджів ультрафіолетовими променями проводиться їхнє збагачення вітаміном D2, що утвориться із вмісного в них эргостерину.

Бактеріальні білкові концентрати містять у середньому 60-80% сирого білка від сухої маси. Комерційна назва препарату, отриманого на основі метанолу - «Меприн», він містить у своєму складі до 70-74% від сухої маси білків, до 5% ліпідів, близько 10% мінеральних речовин, 10-13% нуклеїнових кислот. При цьому найбільш ефективні бактерії пологів Methylomonas, Pseudomonas й ін.

Для поліпшення фізичних властивостей готового продукту кормові білкові речовини випускають у гранульованому виді.

Культивування бактеріальних клітин на газоподібних живильних середовищах відрізняється наступними особливостями. Процес ферментації при вирощуванні мікроорганізмів на газоподібних вуглеводнях представлений на рис. 2.

Рис. 2. Процес ферментації при вирощкванні мікроорганізмів

на газоподібних вуглеводнях:

/ - корпус ферментера; 2 - охолоджувальна сорочка; 3 - мішалка; 4 - привід мішалки; 5 - подача газоподібних вуглеводнів; 6 - подача кисневмісного газу; 7 - подача рідкої живильної суміші; 8 — подача посівної культури; 9 — вихід мікробної суспензії по закінченні ферментації; 10 — випуск газу з ферментера; 11 — вихід газової суміші на рециркуляцію; 12 — газоаналізатор, що подає сигнал на регулюючий пристрій клапана; 13 - регулятор тиску усередині ферментера; 14-улавливатель вуглекислого газу

З метою кращої утилізації сировини мікроорганізмами в такому ферментері передбачається рециркуляція газової суміші. Для забезпечення необхідної аерації культури бактерій виробляється продувка ферментера повітрям або киснем. Найчастіше на газових живильних вирощувати середовищах бактерії роду Methylococcus, здатні при оптимальних умовах утилізувати до 85-90% подаваного у ферментер метану. Всі технологічні лінії, пов'язані з культивуванням бактерій у газовому середовищі, вимагають точного контролю за складом цього середовища й оснащення виробничих установок герметизированим, вибухобезпечним устаткуванням.

По закінченні ферментації клітини бактерій піддаються такої ж технології обробки, як і дріжджові клітини.

У зв'язку з тим, що газове середовище з метану й повітря вибухонебезпечні й для кращої утилізації метану бактеріями потрібна постійна рециркуляція, виробництво кормового білка з газоподібних продуктів є досить складним і дорогим.

1.6. Технологія культивування мікроорганізмів у спочиваючому стані без аерації

Деякі організми належать до групи мікроаерофільних (збудники бруцельозу, лептоспірозу, кампілобактеріозу й ін.), не потребуючої примусової аерації живильного середовища в якому вони вирощуються.

Застосовують балонний і реакторний способи культивування.

Балонний спосіб, зокрема для культивування лептоспір, полягає в тому, що мікробні культури лептоспір кожного серологічного варіанта вирощуються в 16-літрових скляних балонах з 10-12 л сироватковою або альбуміно-сивороточною (виробничою) середовищами при температурі 27-28°С протягом 5-7 діб.

1.7. Технологія промислового культивування анаеробних мікроорганізмів

До анаеробних мікроорганізмів відносяться такі, які здатні жити й розмножуватися при відсутності атмосферного кисню.

У силу біологічних особливостей анаеробів методи культивування їх у промисловості мають свої особливості.

1. При культивуванні анаеробних мікроорганізмів потрібно в реакторах створити умови повного витиснення з живильного середовища вільного кисню. Це досягається шляхом заповнення анаеробостатів газовою сумішшю водню й двоокису вуглецю, а залишковий кисень може бути вилучений шляхом каталітичного зв'язування з повітрям.

Анаеробні умови можуть бути досягнуті також додаванням у середовище відновлюючих агентів, таких як цистеїн й сульфід натрію, аскорбінової кислоти.

2.  Ступінь анаеробіозу визначається окислювально-відновним потенціалом (Eh). Для цих цілей у середовище вводять
окислювально-відновні індикатори, найчастіше використають резазурин (діазорезоурин), що міняє колір від синьо-рожевого до безбарвного. Безбарвний стан досягається при Eh близько  100 мв і вказує на наявність
анаеробних умов.

3.  При культивуванні анаеробів необхідно постійно
коректувати рН середовища, підтримуючи його в межах 7,2-7,8. У
процесі росту анаеробів рН середовища дуже швидко знижується в
кислу сторону, що приводить до інгібіровання їхнього росту.

1.8. Періодичні й хемостатні системи культивування мікроорганізмів

При глибинному вирощуванні мікроорганізмів їхні культури можуть перебувати в періодичних, або «закритих», і хемостатних (безперервних), або «відкритих», системах.

Закритою називають таку систему (культуру), коли хоча б один з компонентів живильного або середовища вона вся може не проступати в систему, не залишати її. У такій системі швидкість росту мікроорганізмів повинна після прискорення прагнути до нуля через недолік субстрату або через загибель мікробних клітин внаслідок нагромадження продуктів метаболізму. Отже, періодичні культури мікроорганізмів перебувають у нестійкому стані.

Відкрита (хемостатна) система - це система, коли всі живильні компоненти можуть надходити в реактор, у якому вирощується той або інший мікроорганізм, і віддалятися з реактора у вигляді продуктів синтезу мікроорганізмів (антибіотики, вітаміни, ферменти й т.д.) або біомаси самих мікроорганізмів. При цьому швидкість надходження живильного середовища в реактор і видалення з нього продуктів синтезу або біомаси можна регулювати в потрібному нам середовище розмноження мікроорганізмів.

1.8.1. Періодичне культивування мікроорганізмів

У періодичному стані динаміка росту й розмноження мікроорганізмів у рідкому живильному середовищі має ряд особливостей, загальних для бактерій, актиноміцетів, мікроскопічних грибів, мікоплазм й інших про- і еукаріот. При індивідуальному розвитку їм властива висока швидкість розмноження. Розвиток відбувається у вигляді послідовних фаз, характер і тривалість яких залежать від фізіологічного стану клітин, обумовленого, у свою чергу, умовами різноманітних факторів середовища, у якій розвивається популяція того або іншого організму.

Інакше кажучи, фази росту мікроорганізму відбивають кількісні і якісні зміни в їхній біомасі й навколишнім середовищі.

У простій гомогенній періодичній культурі мікроорганізмів виділяють від 4 до 8 і навіть до 16 фаз.

Ріст мікробної популяції зображують звичайно графіками, відкладаючи на осі абсцис час росту, а на осі ординат - число мікробних клітин (рис. 3).

Рис. 3. Ріст мікробної популяції при періодичному культивуванні

Кожна фаза наведеного графіка є підсумованим вираженням розмноження й відмирання клітин у мікробній популяції. Оскільки мікробні клітини діляться в різному темпі, те представлена на графіку крива наростання їхнього числа на початку й зменшення числа живих клітин наприкінці росту має вигляд пологої лінії. Форма цієї кривої (S-образна) є універсальною й не залежать від виду мікроорганізмів й умов культивування.

Кожна із зазначених на графіку (рис. 3) фаз росту й розмноження характеризується в такий спосіб:

а)               вихідна фаза (лаг-фаза або інукційний період) є фазою затримки росту, коли розмноження мікробних клітин не відбувається. Дана фаза характеризується відсутністю росту клітин. У цей період посівна культура пристосовується до зовнішніх умов, що змінилися, і виробляє ферменти, необхідні для росту на даному живильному середовище. У лаг-фазі в клітинах культури відбуваються значні якісні зміни: зростає кількість нуклеїнових кислот, у першу чергу РНК, активізуються одні ферменти й
синтезуються інші.

Тривалість лаг-фази залежить від наступних факторів:

-    від складу живильного середовища, якщо живильне середовище
по складу мало відрізняється від середовища, на якій росла посівна культура, лаг-фаза може бути практично відсутньою ;

-    від якості посівного матеріалу, а саме, кількості в
ньому життєздатних клітин, їхнього віку, способу зберігання;

-    від посівної дози;

б)               період позитивного прискорення росту. Тривалість
цього періоду для більшості мікроорганізмів становить 2
години й залежить від температури, складу живильного , середовища якості посівного матеріалу. Багато авторів ці дві фази розглядають разом. Число клітин залишається постійним через відсутність у цей період клітинного розподілу. Загальний стан мікробних клітин характеризується як стан пристосування   до живильного середовища . У цей період підсилюється синтез речовини, клітин, вони збільшуються в розмірі, у них утвориться велика кількість індуцибельних ферментів;

в)              фаза логарифмічного (лог-фаза), або експоненци­ального (показового), росту. Вона характеризується постійною й максимальною швидкістю росту клітин. Ріст мікробів у цю фазу відбувається в геометричній прогресії. Тривалість цієї фази залежить:

-    від запасів живильних речовин у середовищі;

-    від умов аерації;

-    від перемішування й ін. факторів.

Для опису процесів росту мікроорганізмів використають такі характеристики, як загальна й питома швидкості росту біомаси (або числа клітин). Іншою важливою характеристикою росту культури є час генерації, за яке біомаса культури подвоюється. Час генерації з різних культур мікроорганізмів сильно розрізняється. Найбільше бистрорастучі бактерії при сприятливих умовах мають період генерації -              20-25 хв.

Тривалість генерації в лог-фазі в різних мікроорганізмів неоднакова. Так, для сальмонел вона дорівнює 20-30 хв., для стрептококів і стафілококів - 25-35 хв., для ешеріхій - 15-17 хв.

На тривалість генерації впливають температура, рН середовища, склад середовища й т.д.

Висока швидкість розвитку мікроорганізмів зберігається на всій експонентній стадії. Однак ця залежність спостерігається протягом обмеженого часу. У міру росту культури в середовищі поступово споживаються живильні речовини, накопичуються продукти обміну, утрудняється транспорт живильних речовин (у першу чергу кисню) і метаболітів внаслідок збільшення щільності популяції;

г)              фаза негативного прискорення. У цю фазу швидкість
розмноження сповільнюється, а час генерації збільшується.
Настання даної фази обумовлено виснаженням живильного середовища й нагромадженням у культуральній рідині токсичних речовин, які починають інгібіровати розвиток культури. Крім того, у цю фазу відбувається найвище нагромадження мікробної маси в одиниці об'єму;