Лабораторная диагностика инфекционных болезней

ПЛАН

1. Основні принципи культивування патогенних мікроорганізмів….2

1.1. Особливості технології промислового культивування мікроорганізмів….2

1.2. Відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними….3

1.3. Готування посівної мікробної культури….4

1.4. Готування й стерилізація живильних сред….4

1.5. Підготовка біореакторів до посіву й вирощування мікроорганізмів….6

1.6. Технологія культивування мікроорганізмів у спочиваючому стані без аерації….9

1.7. Технологія промислового культивування анаеробних мікроорганізмів….9

1.8. Періодичні й хемостатні системи культивування мікроорганізмів….9

1.8.1. Періодичне культивування мікроорганізмів....10

1.8.2. Хемостатна культура, або метод безперервного культивування мікроорганізмів....12

2. Принципи лабораторної діагностики інфекційних захворювань….14

2.1 Мікробіологічний метод….14

2.2 Бактеріологічний метод….17

2.3 Вірусологічний метод….20

2.4 Біологічний метод….21

2.5 Імунологічний метод….21

2.6 Серологічні реакції….22

2.7 Імунологічні методи із застосуванням хімічних міток….24

2.8 Імуноферментний аналіз (ІФА)….25

2.9 Імунний блоттінг….26

2.10 Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)….26

2.11 Гібридизація нуклеїнових кислот….27

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. ОСНОВНІ ПРИНЦИПИ КУЛЬТИВУВАННЯ ПАТОГЕННИХ МІКРООРГАНІЗМІВ.

Клітинна інженерія - один з найбільш важливих направлень у біотехнології, об'єктами якої є мікроби (бактерії, віруси, протозойні організми), а також клітини (тканини) рослин, тварин і людини.

Відтворення мікроорганізмів при використанні різних по складу й властивостям живильних ( середовищ in vitro) або в умовах перебування сприйнятливого організму називається культивуванням.

Культивування мікроорганізмів в умовах in vitro отримало назву промислового культивування, а культивування клітин і тканин рослин і тварин - культивуванням ізольованих клітин і тканин.

При промисловому культивуванні процес мікробного синтезу, як правило, є частиною многостадійного виробництва, у результаті якого одержують як цільовий товарний продукт біосинтезу (дріжджі, кормовий білок, незамінні амінокислоти й ін.), так й «сирий» продукт, що підлягає подальшій переробці (згусток казеїну й ін.).

Метод культивування ізольованих еукаріотичних клітин і тканин в умовах in vitro використають у біотехнології для збереження й розмноження коштовних генотипів, ембріогенезі, оздоровленню посадкового матеріалу, а також для одержання продуктів вторинного синтезу (алколоїди, стероїди, глікозиди, гормони, ефірні масла й ін.).

Таким чином, клітинна біотехнологія базується на здатності клітин до існування й розмноження in vitro, їх тотипотентності й регенерації. Застосування цих особливостей розкрило більші можливості в вирішенні глобальних теоретичних і практичних завдань. В області фундаментальних наук стало здійсненним дослідження таких складних проблем, як взаємодія клітин у тканинах, клітинна диференційовка, морфогенез, реалізація тотипотентності клітин, механізми появи ракових клітин й ін.

1.1. Особливості технології промислового культивування мікроорганізмів

Для здійснення будь-якого біотехнологічного процесу необхідні:

-    культура мікроорганізмів;

-    живильне ; середовище

-    апаратури для вирощування й проведення допоміжних операцій;

-    засоби контролю й керування процесом.

Культивування є основною стадією технологічного процесу й багато в чому визначає кількісні і якісні характеристики виробництва препаратів. На стадії культивування здійснюється нагромадження як самої біомаси, так і продуктів метаболізму (життєдіяльності) мікроорганізмів. Так, при виробництві бактеріальних препаратів цільовим продуктом є сама біомаса, в інших випадках продукти, синтезовані клітиною, - антибіотики, ферменти, амінокислоти й ін. При цьому синтезований продукт може накопичуватися як усередині клітин, так і виділятися в культуральну суміш.

У тому випадку, коли культура росте на поверхні рідкого або щільного живильного , середовища споживаючи субстрати, що втримуються в ній, і виділяючи в це середовище продукти метаболізму, спосіб культивування називають поверхневим.

Коли ж мікроорганізми розподіляються по всьому об'єму рідкого живильного  середовища, культивування називають глибинним (рідкофазним). У такому випадку кисень надходить до клітин у результаті інтенсивної операції перемішування.

Останній спосіб найбільше широко застосовується в цей час у виробництві більшості препаратів по наступних причинах:

1. Дозволяє одержати велику кількість бактеріальної маси за короткий час. Так, при культивуванні мікроорганізмів групи кишкової палички в умовах стану спокою кількість мікробів не перевищує 1-2 млрд/см3, а при застосуванні примусової аерації врожайність досягає 50-60 млрд/см3.

2.  Процес легко керуємий. З метою тривалої підтримки росту й розмноження мікроорганізмів у процесі їхнього
культивування додатково вводять вуглецеві й азотисті
з'єднання, а при необхідності й інші стимулятори росту.
Даний спосіб також дозволяє легко коректувати рН середовища в процесі культивування.

3.  Процес максимально технологічний.

Технологічний процес глибинного вирощування мікроорганізмів у реакторах (ферментерах) складається з наступних етапів:

-    відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними;

-    готування посівної мікробної культури;

-    готування й стерилізація живильних ; середовищ

-    підготовка біореактора до посіву;

-    вирощування мікроорганізмів у реакторі й контроль над
процесом культивування.

Крім того, він включає ряд допоміжних операцій:

-    стерилізацію обладнання й комунікацій;

-    готування й стерилізацію піногасників, розчинів й ін.

Зупинимося на кожному з етапів культивування.

1.2. Відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними

Еталонні штами мікроорганізмів зберігаються й підтримуються на заданому рівні у ВДНІКІ (Всесоюзний державний науково-дослідний інститут клітинної інженерії) ветеринарних препаратів. Ці штами, у свою чергу, є виробничими, оскільки на їхній основі готуються вакцини.

Поряд з виробничими й еталонними штамами у ВДНІКІ зберігаються контрольні штами, які використовують для оцінки якості вакцинних препаратів. Ці штами повинні бути генетично однорідними популяціями мікроорганізмів зі стабільними морфологічними, специфічними й біологічними властивостями. Основними вимогами до цих штамів є їх високі антигенні й імуногенні властивості.

Виробничі, еталонні штами повинні зберігати генетичну стабільність антигенних, імуногенних й інших властивих їм біологічних властивостей протягом 10-20 послідовних пересівань як in vivo, так й in vitro.

1.3. Готування посівної мікробної культури

Звичайно виробниче культивування мікроорганізмів здійснюється в більших обсягах. Тому спочатку з наявного еталонного штаму мікроорганізму, що перебуває, як правило, у ліофільно висушеному стані в ампулі, роблять посіви в невеликі ємності, наприклад, у флаконі місткістю 100-200см3, заповнені по 50-150 мл виробничим середовищем. Потім із флаконів роблять висіви в більші ємності (сулії обсягом 18-20 л).

При гарному нагромадженні мікроорганізмів таку культуру вносять у реактор і називають посівною (матковою) культурою. При цьому потрібно попередньо розрахувати необхідну кількість посівної культури для виробничого культивування мікроорганізмів виходячи з посівної дози, що звичайно становить від 1 до 10% по обсягу. Посівні мікробні культури також контролюються на збереження ними типових морфологічних, культурально-біохімічних, антигенних й імуногенних властивостей, а також на відсутність у них сторонньої мікрофлори (ПМФ).

1.4. Готування й стерилізація живильних сред

Основним принципом конструювання живильних середовищ середовищ являється їхня повноцінність, оскільки в процесі росту мікроорганізми споживають із навколишнього живильного цілого середовища ряд різноманітних хімічних речовин, що становлять основу енергетичного й конструктивного обміну в клітинах.

До основних компонентів, що формують клітинну речовину, ставляться: вуглець, азот, кисень і водень. Вміст цих елементів у різних мікроорганізмах практично постійно.

У результаті розмаїтості мікроорганізмів, що по-різному використовують вуглець й азот, однаково придатних (універсальних) живильних для середовищ росту всіх без винятку мікроорганізмів і клітин не існує. Їхня специфічність залежить від змісту в них вуглецю й азоту.

Залежно від типів використовуваних азотистих з'єднань мікроорганізми розділяються на дві групи:

1. Протеолітичні, тобто розщеплюючі високомолекулярні білкові речовини і пептиди.

2. Дезаминирующие, що вимагають присутності в середовищі готових амінокислот, розщеплення яких супроводжується виділенням аміаку.

Вважається, що живильні середовища повинні бути збалансовані по вмісту таких органічних речовин, як амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, пуринові й піримідинові основи, гормони й ін., додавання яких у дуже незначних кількостях стимулює ріст і розмноження мікроорганізмів.

Дуже часто мікроорганізми й клітини мають потребу в багатьох природних амінокислотах, які є універсальними компонентами харчування. Вони цілком включаються в структуру клітини. Із всіх незамінних амінокислот ключова роль належить глутаміну й аргініну, які мають принципове значення для знешкодження токсичних метаболітів незамінних амінокислот й аміаку.

Також необхідним компонентом живильних середовищ являється неорганічні солі, які обумовлюють необхідний осмотичний тиск середовища, величину рН і буферну ємність.

Другим найбільш важливим принципом конструювання живильних середовищ являється вибір сировинних джерел. Визначальну роль у даному питанні грають, насамперед, біохімічні показники складу сировини, від якого залежить вибір способу й режимів його переробки з метою найбільш повного й ефективного використання живильних речовин, що втримуються в ньому.

Для одержання живильних середовищ із особливо коштовними властивостями застосовують насамперед традиційні джерела білка тваринного походження: м'ясо великої рогатої худоби, казеїн, рибу й продукти її переробки. Їхня питома вага становить до 80%.

Найбільш широко застосовуються живильні середовища на основі м'яса великої рогатої худоби. Також широке поширення одержало рибне кісткове борошно (РКБ), що задовольняє вимогам біологічної цінності, доступності й відносній стандартності.

Живильні на середовища основі казеїну містять всі компоненти, наявні в молоці: жир, лактозу, вітаміни, ферменти й солі. Однак у результаті подорожчання продуктів переробки молока застосування таких середовищ носить обмежений характер.

З нехарчових джерел білка тваринного походження як сировина використовуються кров забійних тварин, селезінка, плацента, ембріони свійських тварин, сирна сироватка, м'які тканини молюсків і ластоногих й ін. Питома вага нехарчової сировини в технології конструювання живильних середовищ складає всього 15%.

У цілому живильні середовища приготовлені із сировини тварини походження, мають високий зміст основних живильних компонентів, є повноцінними й збалансованими по амінокислотному складу й досить добре вивчені.

Варто враховувати, що рибне й кісткове борошно, а також відходи тваринного походження, в усі більшому обсязі направляються на одержання харчових білків, тому потрібні повноцінні їхні замінники, здатні збалансувати нестачу білків і незамінних амінокислот.

У результаті вивчення різних мікроорганізмів було виявлено, що високою інтенсивністю синтезу білків відрізняються мікробні клітини, такі як дріжджі, бактерії й ін. Амінокислотний склад мікроорганізмів, слугуючих субстратом для готування живильних середовищ добре вивчений, а біомаса використовуваних мікроорганізмів є повноцінною по складу живильних речовин (до 60% сухої маси білків) і характеризується підвищеним вмістом лізину й треоніну.

Із продуктів рослинного походження як білковий субстрат можна використовувати кукурудзу, сою, горох, картоплю, люпин й ін. Однак рослинна сільськогосподарська сировина містить білок, незбалансований склад якого залежить від умов вирощування культур, а також липи-ды в більших кількостях, ніж продукти тваринного походження.

В теперішній час нашою біологічною промисловістю на основі гідролізу рослинної сировини виробляється значний обсяг кормового білка для сільського господарства.

Як вихідна сировина для виробництва кормового білка можуть використовуватися найдешевші джерела, такі як відходи целюлозної й деревообробної промисловості, солома, бавовняна лушпайка, кошики соняшника, стрижні кукурудзяних качанів, бурячна меласа, картопляна мезга, пивна дробина, барда спиртових виробництв, відходи кондитерської і молочної промисловості.

Крім того, у Росії (в 1971 р.) і деяких інших нафтовидобувних країнах розробляються технології одержання кормових дріжджів з н-парафінів нафти. Дріжджові клітини можуть використовувати як джерела вуглецю для їхнього росту нерозгалужені вуглеводні із числом вуглецевих атомів від 10 до 30.