Лабораторная диагностика инфекционных болезней

д)              стаціонарна фаза росту, або максимуму, протягом якої чисельність мікробної популяції не зменшується. У цю фазу швидкість розмноження й відмирання клітин однакова. Концентрація живих клітин у дану фазу досягає максимуму, і вона називається М-концентрацією. У цій фазі сама біомаса мікроорганізмів і продуктів їхнього біосинтезу володіє найбільшою біотехнологічною цінністю;

е) фаза відмирання мікробної популяції. Будь-яка мікробна популяція, що росте в судині з незмінюваним середовищем, вступає після фази стаціонарного росту в стадію відмирання. По швидкості відмирання спочатку встановлюють фазу прискореного відмирання (VI), потім фазу постійної швидкості відмирання (VII) і фазу вповільненої швидкості відмирання (VIII). Причинами відмирання мікробної популяції є виснаження середовища й нагромадження в ньому великої кількості токсичних продуктів метаболізму. У період стадії відмирання загальна кількість біомаси зменшується, що найчастіше відбувається за рахунок аутолізу.

Тривалість стадії відмирання в різних мікроорганізмів неоднакова: у пневмокока вона становить 2-3 доби, в ешеріхій - кілька місяців. У цей період у культурі спостерігається значне зменшення клітин. У них зменшується біохімічна й антигенна активність.

З огляду на це, для виготовлення ряду біопрепаратів відбирають культури мікроорганізмів найчастіше у фазі негативного прискорення росту або на початку стаціонарної фази росту, коли концентрація живих мікробних клітин наближається або дорівнює М-концентрації.

1.8.2. Хемостатна культура, або метод безперервного культивування мікроорганізмів

Хемостатна, або безперервна, культура являє собою потокову культуру тих або інших мікроорганізмів. У такому випадку можливість продовження життя мікробної популяції підтримується за допомогою безперервної подачі свіжого середовища й постійного добору мікробної біомаси або продуктів, що утворилися, метаболізму, тобто можна культуру мікроорганізму як би зафіксувати в одній, наприклад, стаціонарній, фазі росту й одержати потрібні продукти обміну або біомасу в часі стільки, скільки потрібно. Таким чином, максимальна продуктивність у хемостатної культурі завжди вище, ніж максимальна продуктивність у періодичній культурі.

Потрібно сказати, що до 50-х років для культивування мікроорганізмів з метою їхнього всебічного вивчення служила проста періодична культура. Тільки з переходом до методу хемостатного культивування виявився недолік періодичної культури, що не дає повного уявлення про всі зміни, що відбуваються в клітині, і про вплив зовнішніх факторів на процеси, що протікають у ній.

Розвиток хемостатного культивування відкрило можливість управляти процесом, контролюючи ріст і поведінку мікроорганізмів, а при необхідності втручатися в цей процес, змінюючи швидкість росту до меж, що задають, шляхом впливу на таку культуру зовнішніми факторами. У цей час інтерес до безперервного культивування росте як у нашій країні, так і за рубежем.

2. ПРИНЦИПИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ.

Лабораторні дослідження відіграють важливу роль у встановленні діагнозу інфекційних хвороб, призначенні етіотропної терапії, проведенні контролю за ефективністю лікування. Процес специфічної лабораторної діагностики заснований на виявленні збудника й відповідної реакції організму людини в ході інфекційного процесу. Він складається із трьох етапів: збору матеріалу, транспортування і його дослідження в лабораторії. До проведення кожного етапу висувають певні вимоги, від дотримання яких залежить ефективність лабораторної діагностики. Завдання лікаря полягає в правильному виборі методу дослідження й грамотній оцінці його результатів.

Лабораторні методи діагностики різні по чутливості й специфічності. Чутливість методу відбиває ймовірність того, що результат тесту буде позитивним в інфікованого пацієнта й визначається відношенням загального числа позитивних результатів до загального числа інфікованих пацієнтів. Чим вище чутливість тесту, тим менше ймовірність одержання ложнонегативних результатів. Критерій специфічності відбиває ймовірність того, що результат тесту буде позитивним у неінфікованого пацієнта, і його обчислюють як відношення загального числа негативних результатів до загального числа неінфікованих пацієнтів. Чим менше специфічність, тим більше ймовірність одержання ложнопозитивних результатів. Обидва показники виражають у відсотках.

2.1 Мікробіологічний метод

Мікробіологічний метод діагностики заснований на виявленні збудників у біологічному матеріалі. Використають світлооптичну й електронну мікроскопію.

Мікробіологічний метод широко застосовують у діагностиці інфекційних хвороб бактеріальної, протозойної етіології й, рідше, вірусних хвороб.

У практиці роботи бактеріологічної лабораторії мікроскопічне дослідження в більшості випадків має значення прискореної орієнтовної діагностики. Основними завданнями мікроскопії служать виявлення збудника в клінічному матеріалі, орієнтовна ідентифікація на підставі визначення характерних морфологічних і тінкторіальних ознак бактерій, а також вивчення пофарбованих мазків з колоній чистих культур.

Матеріалом для мікроскопічного дослідження можуть бути кров, кістковий мозок, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, фекалії, дуоденальний вміст і жовч, сеча, мокротиння, відокремлюване сечостатевих шляхів, біоптати тканин, мазки зі слизової оболонки ротової порожнини, піднебінних мигдалин, носа й ін.

Для виявлення «кровіпаразитів», наприклад найпростіших (малярійні плазмодії, трипаносоми, лейшманії, бабезії) і гельмінтів (мікрофілярії), досліджують препарати «тонкий мазок» й/або «товста крапля» крові.

Препарат «товста крапля» готують двома способами: а) до краплі крові на місці проколу (на пальці, мочці вуха) доторкаються предметним склом і круговими рухами розподіляють краплю до діаметра 15—20 мм, на предметне скло доцільно нанести 2 краплі; б) на предметному склі готують спочатку мазок трохи товще звичайного, потім, поки він ще не висохнув, на нього наносять 1 або 2 краплі крові, які спонтанно розтікаються рівномірними дисками. Підсихати «товсті краплі» повинні поступово на повітрі, без підігріву, в умовах захисту їх від ушкодження комахами. Препарати крові офарблюють без попередньої фіксації по Романовскому-Гімзе.

Для готування тонкого мазка роблять відбиток крові поблизу краю предметного скла, потім ребром під кутом 45° підводять до краплі шліфоване скло й після розтікання крові уздовж його краю безперервним рухом розподіляють кров по поверхні предметного скла. Отриманий препарат фіксують й офарблюють.

Спинномозкову рідину для мікробіологічного дослідження відбирають у стерильну пробірку під час люмбальної пункції. Для готування препарату використають осад, що утвориться спонтанно або в результаті центрифугувания.

Мазки зі слизової оболонки ротової порожнини беруть натще або через 2 години після їжі стерильним ватним тампоном, мазок-відбиток готують на предметному склі. При наявності плівки останню знімають стерильним пінцетом. Матеріал з носової порожнини забирають стерильним ватним тампоном, що вводять всередину порожнини носа. Мазок з носоглотки беруть стерильним  тампоном, уводячи його обережно через носовий отвір у носоглотку. Для проведення аналізів на дифтерію досліджують одночасно плівки й слиз із носа й глотки. Матеріал з носа й глотки беруть різними тампонами.

Сечу для мікроскопічного дослідження збирають у стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх полових органів. Для готування препарату використають осад сечі.

Мікроскопічному дослідженню піддають нативні (нефіксовані, незабарвлені) і пофарбовані препарати. У першому випадку виявляють живі мікроорганізми в препараті «висяча крапля» або «роздавлена крапля», оцінюючи рухливість і морфологічні властивості збудника. Наприклад, темнопольну мікроскопію нативних препаратів використають для діагностики спірохетозів (первинного сифілісу, лептоспірозу, епідемічного  зворотного тифу), кандидозу або інших грибкових захворювань. У цих випадках результат мікроскопічного дослідження дає підставу для постановки діагнозу.

Найбільше широко застосовують мікроскопію мікроорганізмів у пофарбованому стані, зокрема для діагностики паразитарних хвороб (малярія, амебіаз, лямбліоз, лейшманіоз, гельмінтози). Для фарбування препаратів використають орієнтовні, спеціальні й диференційовані методи. Орієнтовне фарбування дозволяє оцінити загальну морфологію мікроорганізму. Із цією метою застосовують стандартні барвники - фуксин або метиленовий синій.

Серед спеціальних методів найбільше часто використають фарбування по Граму. Цей метод виявляє здатність бактерій утримувати барвник кристалічний фіолетовий (або генціановий фіолетовий) або знебарвлюватися в спирті. Грампозитивні бактерії офарблюються у фіолетові кольори, а грамнегативні - у червоний, тому що вони знебарвлюються в спирті і їх додатково офарблюють фуксином. Фарбування збудників по Граму дозволяє визначити первинний вибір засобів антибактеріальної терапії.

До спеціальних методів відносять фарбування по Цилю- Нільсену, що виявляє кислото- і спиртостійкі палички, зокрема мікобактерії туберкульозу, які офарблюються в червоні кольори, а інші мікроорганізми - у синій.

Диференціюючими називають методи фарбування окремих елементів бактеріальної клітини. Наприклад, фарбування метахроматинових (волютинових) включень у бактеріях (по Нейссеру, Майєру), фарбування капсул (по Гіссу, Лейфсону, Антоні), суперечка, жгутиків (по Леффлеру, Бейлі, Грію й ін.), клітинної стінки, хроматинових (ядерних) елементів (по Романовскому-Гімзе й Пекарському).

До мікроскопічних методів дослідження відносять імунофлюоресценцію (люмінесцентна мікроскопія), використовувану для діагностики бактеріальних і вірусних інфекцій і засновану на застосуванні антитіл, мічених флюоресцируючим барвником.

Ефективність мікроскопічного методу визначається його чутливістю й специфічністю. Специфічність обмежується можливою помилковою ідентифікацією збудника через артефакти. Крім того, при проведенні мікроскопічного дослідження мають значення техніка дослідження; наприклад, при діагностиці малярії чутливість дослідження крові методом «товстої краплі» в 20-40 разів вище, ніж при дослідженні методом тонкого мазка, оскільки даний препарат дозволяє переглядати більший об'єм крові, а крім того, плазмодії в препараті розташовуються внеклітинно, що полегшує їхнє виявлення й кількісну оцінку.

Проте чутливість методу «товстої краплі», проведеного по стандартах ВІЗ (дослідження мінімум 100 полів зору протягом мінімум 5 хв), все-таки не перевищує 95 % через нерівномірність розподілу малярійних плазмодіїв крові, особливо при низькому рівні паразитемії.

Важливим способом підвищення чутливості мікробіологічного методу є використання різних способів концентрації патогенів, наприклад осадження або флотація проби при дослідженні калу й фільтрація через міліпорові фільтри проб крові, силі, спинномозковій рідині.

Підвищенню ефективності мікроскопічного дослідження сприяє кількісне визначення виявленого паразита в полі зору або одиниці об'єму досліджуваного матеріалу. Зокрема, при малярії (особливо при виявленні P.falciparum) важливе визначення інтенсивності паразитемії.

Кількісна оцінка мікрофлори в мазку, а також виявлення мікробних асоціацій важливі якщо буде потреба визначення етіологічної ролі умовно-патогенних мікроорганізмів.

Для більшості видів досліджуваного матеріалу етіологічно значимим уважається виявлення умовно-патогенних бактерій певного виду в концентрації не менш 105—106 клітин в 1 мл, тому чутливість мікроскопічного методу в більшості випадків задовольняє потреби клінічної мікробіології.

2.2 Бактеріологічний метод

Застосування бактеріологічного методу дає можливість виділити збудника в чистій культурі з матеріалу, отриманого від хворого, і ідентифікувати його на підставі вивчення комплексу властивостей. Більшість бактерій здатні до культивування на різних штучних живильних ( середовищахкрім хламідій і рикетсій), тому бактеріологічний метод має важливе значення в діагностиці багатьох інфекційних хвороб.

У випадку одержання позитивного результату бактеріологічний метод дозволяє визначити чутливість виділеного збудника до антимікробних препаратів. Однак ефективність зазначеного дослідження залежить від багатьох параметрів, зокрема від умов збору матеріалу і його транспортування в лабораторію.

ДО основним вимогам, пропонованим до відбору й транспортування матеріалу для бактеріологічного дослідження, відносять:

•        узяття матеріалу до початку етіотропного лікування;

•        дотримання умов стерильності при зборі матеріалу;

•        технічну правильність збору матеріалу;

•        достатня кількість матеріалу;

•        забезпечення температурного режиму зберігання й транспортування матеріалу;

•        відомість до мінімального проміжку часу між збором матеріалу й посівом на щільні живильні . середовища

Транспортування матеріалу в лабораторію повинна бути здійснена по можливості негайно, але не більш ніж протягом 1—2 г після його узяття. Проби матеріалу повинні перебувати при певному температурному режимі; зокрема, стерильні в нормі матеріали (кров, спинномозкова рідина) зберігають і доставляють у лабораторію при 37 °С. Нестерильні матеріали (сеча, відокремлюване дихальних шляхів й ін.) зберігають при кімнатній температурі не більше 1—2 г або не більше доби при 4 °С (умови побутового холодильника). При неможливості доставки проб у лабораторію в регламентований термін рекомендують використати транспортні середовища, призначені для збереження життєздатності збудників в умовах консервації.