Лабораторная диагностика инфекционных болезней

•        Кров для дослідження варто брати у хворого в період підйому температури тіла, на початку появи лихоманки. Рекомендується досліджувати 3-4 проби крові, узяті з інтервалом 4-6 г, що обґрунтовано з погляду зниження ризику «упустити» транзиторну бактеріемію й підвищення можливості підтвердити етіологічну роль виділеної із крові умовно-патогенної мікрофлори (наприклад, Staphylococcus epidermidis), якщо ця мікрофлора виявляється в декількох пробах венозної крові. Пробу крові в кількості 10 мол у дорослого й 5 мл у дітей засівають мінімум у два флакони із середовищем для аеробних й анаеробних мікроорганізмів у співвідношенні 1:10. Бажано однократне дослідження й артеріальної крові.

•        Узяття спинномозкової рідини (СМР) робить лікар при люмбальній пункції в кількості 1—2 мл у суху стерильну пробірку. Пробу негайно доставляють у лабораторію, де до її дослідження приступають також негайно. При відсутності такої можливості матеріал зберігається при 37 °С  протягом декількох годин. Істотно підвищує кількість позитивних результатів бактеріологічного дослідження посів 1—2 крапель СМР у пробірку, що містить напіврідке середовище із глюкозою, і в чашку Петрі з «кров'яним» агаром. Для пересилання матеріалу використають ізотермальні ящики, грілки, термоси або будь-яке інше пакування, де підтримується температура близько 37 °С.

•        Випорожнення для бактеріологічного дослідження відбирають за допомогою стерильних дерев'яних шпателів у кількості 3—5 мл у стерильну посудину із щільно, що закривається кришкою. Дослідження взятого матеріалу повинне бути почате не пізніше ніж через 2 г. Якщо неможливо приступити до дослідження протягом цього часу, варто відібрати невелику кількість матеріалу, що поміщають у відповідне транспортне середовище. При відборі випорожнень варто прагнути направляти для дослідження патологічні домішки (слиз, гній, частки епітелію й ін.), якщо вони є, уникаючи влучення в матеріал домішки крові, що має бактерицидними властивостями.

Для узяття матеріалу можуть бути використані ректальні тампони (з ватним наконечником). Тампон повинен бути зволожений стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду або транспортним середовищем (але не масляним гелем). Його вводять per rectum на глибину 5-6 см й, повертаючи тампон, обережно його витягають, контролюючи появу на тампоні фекального фарбування. Тампон поміщають у суху пробірку, якщо до дослідження матеріалу приступлять протягом 2 г, в іншому випадку - у транспортне середовище.

•        Сечу (середня порція вільно випущеної сечі) у кількості 3—5 мл збирають у стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Краще відбирати ранкові порції сечі.

•        Жовч збирають під час дуоденального зондування в процедурному кабінеті окремо по порціях А, В и С у три стерильні пробірки, дотримуючи правила асептики.

•        Промивні води шлунка збирають у стерильні банки в кількості 20—50 мл. Варто мати на увазі, що промивання шлунка в цих випадках проводять тільки індиферентними (не володіють бактеріостатичною або бактерицидною дією на мікроорганізми) розчинами — краще кип'яченою водою (без додавання соди, перманганату калію й ін.).

•        Мокротиння. Ранкове мокротиння, що виділяється під час нападу кашлю, збирають у стерильну банку. Перед відкашлюванням хворої чистить зуби й полоще рот кип'яченою водою з метою механічного видалення залишків їжі, злущеного епітелію й мікрофлори ротової порожнини.

•        Промивні води бронхів. При бронхоскопії вводять не більше 5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду з наступним його відсмоктуванням у стерильну пробірку.

•        Відокремлюване ковтки, ротовий порожнини й носа. Матеріал з ротової порожнини беруть натще або через 2 г після їжі стерильним ватним тампоном або ложечкою зі слизової оболонки і її уражених ділянок у входів проток слинних залоз, поверхні язика, з ранок. При наявності плівки останню знімають стерильним пінцетом. Матеріал з носової порожнини забирають сухим стерильним ватним тампоном, що вводять у глиб порожнини носа. Матеріал з носоглотки беруть стерильним ватним тампоном, що обережно вводять через носовий отвір у носоглотку. Якщо при цьому починається кашель, тампон не видаляють до закінчення кашлю. Для проведення аналізу на дифтерію досліджують одночасно плівки й слиз із носа й глотки, беручи матеріал різними тампонами.

Досліджуваний матеріал засівають на щільні живильні , середовища використовуючи спеціальні методики для одержання росту окремих колоній мікроорганізмів, які далі отсівають з метою виділення чистої культури збудника.

Певні види бактерій виділяють, використовуючи елективні (виборчі) середовища, які затримують ріст сторонніх мікроорганізмів або містять речовини, що стимулюють ріст певних патогенних мікробів.

Виділені на живильні мікроорганізми середовищах ідентифікують, тобто визначають видову або типову їхню приналежність. Останнім часом для ідентифікації в практиці охорони здоров'я використовують мікротест-системи, що представляють собою панелі з набором диференційно-діагностичних середовищ, що прискорює дослідження. Мікротест-системи застосовують і для визначення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів методом розведення антибіотика в рідкому живильному середовищі

Враховуючи результати бактеріологічного дослідження, лікар повинен ураховувати, що негативний результат не завжди означає відсутність збудника й може бути пов'язаний із застосуванням антимікробних препаратів, високої мікроцидно. активністю крові, технічними погрішностями. Виявлення патогенного мікроба в матеріалі від хворого поза зв'язком із клінічною картиною можливо у випадку реконвалісцентного, здорового або транзиторного бактеріоносійства.

Виділення із крові при дотриманні всіх правил асептики умовно-патогенних мікроорганізмів (епідермальний стафілокок, кишкова паличка) і навіть сапрофітів варто вважати проявом бактеріемії, особливо якщо ці мікроби виявлені більше чим в одній пробі матеріалу або в різних субстратах (кров, сеча), оскільки при зниженні імунореактивності організму ці й інші «непатогенні» мікроорганізми можуть бути збудниками інфекційних процесів, у тому числі й сепсису.

Певну складність представляє трактування результатів бактеріологічного дослідження нестерильних середовищ, а саме доказ етіологічної ролі умовно-патогенних мікроорганізмів. У цьому випадку враховують у комплексі такі показники, як вид виділених культур, кількість мікробних клітин даного виду в матеріалі, повторне їхнє виділення протягом захворювання, присутність монокультури або асоціації мікроорганізму.

2.3 Вірусологічний метод

Вірусологічний метод включає два основних етапи: виділення вірусів й їхню ідентифікацію. Матеріалами можуть бути кров, інші біологічні й патологічні рідини, біоптати органів і тканин.

Вірусологічне дослідження крові часто проводять із метою діагностики арбовірусних інфекцій. У слині можуть бути виявлені віруси сказу, епідемічного паротиту, простого герпеса. Носоглоткові змиви служать для виділення збудників грипу й інших ОРВІ, кору. У змивах з конюнктиви виявляють аденовіруси. З фекалій виділяють різні ентеро-, адено-, рео- і ротавіруси.

Для виділення вірусів використовують культури клітин, курячі ембріони, іноді лабораторних тварин. Більшість патогенних вірусів відрізняє наявність тихорєцької й типової специфічності', наприклад, поліовірус репродукується тільки в клітинах приматів, тому для виділення певного вірусу використовують відповідну культуру тканини. Для виділення невідомого збудника доцільно одномоментно заражати 3-4 культури клітин, припускаючи, що одна з них може виявитися чутливою. Наявність вірусу в заражених культурах визначають по розвитку специфічної дегенерації клітин, тобто цитопатогенній дії, виявленню внутрішньоклітинних включень, а також на основі виявлення специфічного антигену методом імунофлюоресценції, позитивних реакцій гемадсорбції й гемаглютинації. Ембріони птахів з їх малодиференційованими тканинами придатні для культивування дуже багатьох вірусів. Найчастіше використовують ембріони курей. При розмноженні в ембріонах віруси можуть викликати їхню загибель (арбовіруси), поява змін на хоріоналантоїсній оболонці (віспяні віруси) або в тілі ембріона, нагромадження в ембріональних рідинах гемаглютинінів (віруси грипу, паротиту) і комплементзвязуючого вірусного антигену.

Віруси ідентифікують за допомогою імунологічних методів: реакції гальмування гемаглютинації, зв'язування комплементу, нейтралізації, преципітації в гелі, імунофлюоресценції.

2.4 Біологічний метод

Біологічний метод складається в зараженні різним матеріалом (клінічним, лабораторним) лабораторних тварин для індикації збудника, а також для визначення деяких властивостей мікроорганізмів, що характеризують їхня патогенність (токсигенність, токсичність, вірулентність). Як лабораторних тварин використовують білих мишей, білих пацюків, морських свинок, кроликів й ін.

Відтворення захворювання у тварини - абсолютний доказ патогенності виділеного мікроорганізму (у випадку сказу, правця й ін.). Тому біологічна проба на тваринах є коштовним і достовірним діагностичним методом, особливо при тих інфекціях, збудники яких у досліджуваних біологічних середовищах організму людини утримуються в малих концентраціях і погано або повільно ростуть на штучних середовищах.

2.5 Імунологічний метод

Імунологічний метод (серологічний) включає дослідження сироватки крові, а також інших біологічних субстратів для виявлення специфічних антитіл й антигенів. Класична серодіагностика заснована на визначенні антитіл до виявленого або передбачуваного збудника. Позитивний результат реакції свідчить про наявність у досліджуваній сироватці крові антитіл до антигенів збудника, негативний результат вказує на відсутність таких. Виявлення в досліджуваній сироватці крові антитіл до збудника ряду інфекційних хвороб недостатньо для постановки діагнозу, оскільки воно може відбивати наявність постінфекціонного або поствакцинального імунітету, тому досліджують «парні» сироватки крові, першу, узяту в перші дні хвороби, і другу, узяту з інтервалом 7-10 днів. У цьому випадку оцінюють динаміку наростання рівня антитіл.

Діагностично значиме збільшення титру антитіл у досліджуваній сироватці крові не менш ніж в 4 рази щодо первісного рівня. Цей феномен називають сероконверсією. При рідких інфекційних хворобах, а також вірусних гепатитах, Віл-інфекції й деяких інших факт наявності антитіл свідчить про інфікуванні пацієнта й має діагностичне значення.

Крім визначення титру антитіл, при проведенні серологічних досліджень можна встановити ізотип антитіл. Відомо, що при першій зустрічі організму людини зі збудником у гострому періоді хвороби виявляють більше швидке наростання антитіл, що належать до Ig, рівень яких, досягаючи максимального значення, потім знижується. У більш пізній термін хвороби підвищується кількість IgG-антитіл, які довше зберігаються й визначаються в періоді реконвалісценції. При повторній зустрічі зі збудником завдяки імунологічній пам'яті реакції гуморального імунітету проявляються більш швидкою продукцією IgG-антитіл, а антитіла класу М виробляються в незначній кількості. Виявлення IgM-антитіл свідчить про наявність поточного інфекційного процесу, а наявність IgG-антитіл - про перенесену в минулому інфекції або поствакцинальному імунітеті.

З огляду на особливості первинної й вторинної імунної відповіді, аналіз співвідношення Ig-М і IgG-антитіл дозволяє в деяких випадках диференціювати стадію інфекційного процесу (розпал захворювання, реконвалесценція, рецидив). Наприклад, у випадку вірусного гепатиту А (ГА) надійним методом діагностики служить визначення анти-HAV IgM-антитіл у сироватці крові. Їхнє виявлення свідчить про поточній або недавно виниклу HAV-інфекцію.

Серологічне дослідження для виявлення антитіл при інфекційних захворюваннях є більш доступним методом лабораторної діагностики, ніж виділення збудника. Іноді позитивна серологічна реакція є єдиним доказом зустрічі й взаємодії організму зі збудником відповідного інфекційного захворювання. Крім того, ряд захворювань із подібною клінічною картиною (наприклад, рікетсіози, ентеровірусні інфекції) можуть бути диференційовані лише серологічно, що висвітлює значення серологічних методів у діагностиці інфекційних хвороб.

2.6 Серологічні реакції

Серологічні реакції позначають відповідно до феноменів, що супроводжують утворення комплексу антиген — антитіло при взаємодії різних по властивостях компонентів. Розрізняють реакції аглютинації, преципітації й лізису.

                  Реакция аглютинації (РА) заснована на застосуванні корпускулярного антигену (зваж бактерій, сенсибілізованих еритроцитів, часток латексу й ін.), взаємодіючого зі специфічними антитілами, у результаті чого комплекс, що утвориться, антиген - антитіло випадає у вигляді осаду. Цю реакцію широко застосовують у лабораторній практиці для серологічної діагностики бактеріальних інфекцій і для ідентифікації виділених мікроорганізмів.

РА використають для діагностики багатьох інфекційних хвороб: бруцельозу (реакції Райта, Хеддльсона), туляремії, лептоспірозу (РАЛ - реакція аглютинації й лізису лептоспір), лістеріозу, сипного тифу (РАР - реакція аглютинації риккетсій), шигельозу, іерсініозу, псевдотуберкульозу й ін.

   Реакція непрямої, або пасивної, аглютинації (РНГА або РІГА). Для постановки цієї реакції використовують еритроцити тварин (барана, мавпи, морських свинок, деяких птахів), сенсибілізованих антитілами або антигеном, що досягається інкубацією суспензії еритроцитів і розчину антигену або імунної сироватки.

Діагностікуми, отримані на основі еритроцитів, сенсибілізованих антигенами, називають антигенними ерітроцитарними діагностикумами.

Вони призначені для визначення антитіл у серійних розведеннях сироваток крові, наприклад ерітроцитарні шигельозні діагностикуми, ерітроцитарні сальмонельозні О-діагностикуми. Відповідно діагностикуми на основі еритроцитів, сенсибілізованих специфічними імуноглобулінами, називають антительними (імуноглобуліновими) діагностикумами й вони служать для виявлення антигенів у різному матеріалі, наприклад ерітроцитарний імуноглобуліновий дифтерійний діагностикум для РНГА, застосовуваний для виявлення дифтерійного екзотоксину корінебактерій у рідкому живильному середовищі при посіві в ньому матеріалу з носа й ротоглотки.