Мембранная энзимология

На самом деле протеинкиназа  С представлена несколькими разными, но близкими по структуре полипептидами  с мол. массой - 80000. Например, из мозга  кролика выделено три формы. Протеинкиназа  С имеет двухдоменную структуру. Один домен содержит каталитические центры, связывающие АТР и белок-субстрат, и функционирует как сериновая  и треониновая фосфотрансфераза. Второй домен, по-видимому, участвует  в связывании фосфатидилсерина, диацилглицерола  и Са^2 +. С помощью мягкого протеолиза можно разделить два этих домена, получив полностью активный каталитический фрагмент с мол. массой - 50000. Таким образом, активировать фермент можно двумя взаимоисключающими способами: протеолизом и связыванием с мембраной. Таким же образом ведут себя и некоторые другие липидзависимые ферменты, например пируватоксидаза. Физиологическое значение протеолитической активации неясно.

Очищенный фермент был встроен  в фосфолипидные везикулы и в  смешанные везикулы, содержащие тритон Х-100 и фосфолипиды. В обоих случаях  было показано, что само по себе связывание липида ферментом необходимо, но не достаточно для проявления ферментативной активности. Например, для связывания фермента с фосфолипидными везикулами достаточно 2 "Уо фосфатидилсерина, в то время как для оптимального фосфорилирования его необходимо уже 50. В норме содержание фосфати-дилсерина  в плазматической мембране составляет 8-10%. Поскольку фермент активируется в смешанных мицеллах, содержащих примерно 20 мол. % фосфатидилсерина в  тритоне Х-100, наличие бислойной  структуры не является необходимым, что, вообще говоря, весьма типично  для липидзависимых ферментов. Зависимость  наблюдаемой активации от концентрации фосфатидилсерина свидетельствует  о кооперативном характере взаимодействий фермента и липида, что также довольно обычно. По оценкам функционально  активный фермент представляет собой  комплекс, содержащий мономер фермента, одну молекулу диацилглицерола, один или более ионов Са²⁺ и по крайней мере четыре молекулы фосфатидилсерина. Связывание всегда происходит с поверхностью мембраны, но роль Са²⁺ неизвестна. Он может, например, хелатировать карбоксильные группы фосфатидилсерина и какие-то группы в белке и/или играть роль аллостерического регулятора при связывании белка. Тот факт, что фермент может быть помечен иодонафталин-1-азидом, служит указанием на некоторое проникновение белка в гидрофобную зону бислоя, но не более того.

6.2 Эффект поверхностного  разведения в смешанных мицеллах

Рис. иллюстрирует интересную особенность  протеинкиназы С и других мембранных ферментов, выявляемую при измерении  их активности в системах со смешанными мицеллами. В этом эксперименте измеряли зависимость способности фермента связывать форболовый эфир от концентрации тритона Х-100. Если поддерживать постоянным содержание фосфатидилсерина в мольных  процентах, а концентрацию тритона  Х-100 увеличивать, то фермент будет  связывать форболовый эфир даже при  высокой концентрации детергента. Однако если поддерживать постоянной объемную концентрацию фосфолипида и увеличивать  количество детергента, то фермент  перестанет связывать форболовый эфир при высоких концентрациях тритона  Х-100. Для активации фермента важна  не объемная, а поверхностная концентрация липида, иными словами, число молекул  липида на мицеллу. Если эта величина падает, то уменьшаются также способность  фермента связываться с такими смешанными мицеллами и способность активироваться. Это явление называется явлением поверхностного разведения.

6.3 Другие примеры

Лимитирующей стадией биосинтеза фосфатидилхолина является синтез интермедиата CDP-холина. Фермент, катализирующий эту  реакцию, называется СОР: фосфохолин цитидилтрансферазой. Он содержится в цитозоле, но, как было недавно показано, может связываться с эндоплазматическим ретикулумом, где происходит его активация. Именно в месте связывания осуществляется биосинтез фосфатидилхолина. Отметим, что оба субстрата растворимы в воде и не связаны с мембраной. Что заставляет фермент связываться с мембраной, пока неясно. Возможно, сигналом служит появление в мембране диацилглицеролов. Рассматриваются также следующие механизмы:

1) увеличение содержания длинноцепочечных  жирных кислот или ацильных  производных СоА;

2) истощение микросомной мембраны  по фосфатидилхолину;

3) дефосфорилирование самого фермента, в результате чего он переходит  в мембраносвязанную активную  конформацию. Для установления  истинного механизма необходимы  дальнейшие исследования.

Показано, что в зависимости  от содержания мембраносвязанных диацилглицеролов фермент диацилглицеролкиназа может  перемещаться из цитозоля в мембрану. Он катализирует превращение диацилглицерола  в фосфатидную кислоту и по крайней мере частично ответствен за утилизацию диацилглицерола в мембране. Диацилглицерол и жирные кислоты  участвуют также в связывании а-актинина с мембранами. Полагают, что определенную роль в прикреплении пучков микрофиламентов к плазматической мембране играет и диацилглицеролкиназа. Возможно, индуцируемое диацилглицеролом и жирными кислотами образование  комплексов а-актинина и актина является важным элементом физиологической  активности тромбоцитов.

Остановимся вкратце еще на двух ферментах, которые в определенных условиях связываются с биомембранами: пируватоксидазе и фосфатидилсеринсинтетазе из Е. coli. В присутствии субстрата  оба фермента перемещаются из цитозоля в цитоплазматическую мембрану. Пируватоксидаза  уже упоминалась как пример липидзависимого  фермента. В присутствии пирувата, восстанавливающего связанный с  белком флавиновый кофактор, фермент  по своим свойствам становится классическим мембранным белком. Он восстанавливает  растворенный в мембране убихинон и  поэтому для своего функционирования должен быть связан с мембраной. В  норме при очистке фосфатидилсеринсинтазы она выделяется в связанном с  рибосомами виде, но в присутствии  либо субстрата, либо продукта оказывается  связанной с мембраной.

6.4 Растворимые ферменты  или ферментные ансамбли, которые  in vivo могут быть ассоциированы  с мембраной

В литературе все чаще появляются данные о возможной ассоциации целого ряда растворимых ферментов с  мембраной. Большинство работ посвящено  связыванию ферментов цикла трикарбоновых  кислот и /3-окисления жирных кислот с внутренней митохондриальной мембраной  и ферментов гликолиза с плазматической мембраной эритроцитов. Приводятся доказательства, хотя и не вполне убедительные, что ферменты митохондриального  матрикса организованы в связанные  с поверхностью мембраны мультиферментные комплексы. В некоторых случаях  удалось выявить специфические  центры связывания. Например, NAD ⁺ - зависимые дегидрогеназы образуют комплексы с NADH: убихинон оксидоредуктазой. Креатинфосфокиназа специфически связывается с кардиолипином во внутренней митохондриальной мембране; гексокиназа также связывается с митохондриями - возможно, с их наружной мембраной. Распределение гексокиназы между растворенной и связанной с митохондриями формами, по-видимому, модулируется гормонами или метаболитами. Во всех этих случаях смысл ассоциации перечисленных ферментов, а возможно, и других растворимых ферментов с мембраной, состоит в "канализации" субстрата. Например, переносимый через внутреннюю митохондриальную мембрану АТР должен более эффективно утилизироваться гексокиназой, локализованной около мембраны. Однако это предположение пока нельзя считать окончательно доказанным.

В ряде работ показано, что гликолитические  ферменты связываются с экспонированным  в цитоплазму кислым доменом белка  полосы 3 мембраны эритроцитов. В число  этих ферментов входят альдолаза, фосфофруктокиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. Предполагается, что в некоторых  случаях связанный с мембраной  фермент может оставаться в неактивной форме и быстро переходить в активную цитоплазматическую форму в присутствии  соответствующих метаболитов. Пока неясно, правда, происходит ли такая  ассоциация in vivo или это артефакт, связанный с работой in vitro. Взаимодействия между белками в таких ассоциатах относительно слабые и зависят от ионной силы. Такая же картина характерна для некоторых предполагаемых ассоциатов ферментов с митохондриальной мембраной. Однако сопряжение гликолитических  функций с мембранными активностями и компартментализация этих ферментов, вообще говоря, слишком привлекательная  концепция, чтобы ее отбрасывать, тем  более что для других систем существование  таких ассоциатов доказано.

Получить убедительные доказательства физиологической значимости взаимодействия этих ферментов и ферментных ансамблей  с мембраной довольно трудно, но есть основания полагать, что в  недалеком будущем в этой области  исследований будет достигнут определенный прогресс.

Еще один класс взаимодействующих  с мембраной растворимых белков представляют цитотоксины.

6.5 Факторы свертывания  крови - внеклеточные ферменты, активируемые  связыванием с мембраной

Свертывание крови происходит в  результате сложного каскада реакций  с участием целого ряда факторов сыворотки. В ходе этих реакций осуществляется последовательная протеолитическая активация  серии зимогенов, каждый из которых, активировавшись, в свою очередь  вызывает активацию одного или нескольких других зимогенов. Конечным результатом  всех этих реакций является превращение  фибриногена в фибрин. Для осуществления  многих этапов этого каскада необходимо, чтобы активированная протеаза и/или  субстрат-зимоген связалась с  мембраной тромбоцитов, эндотелиальных или иных клеток. Особый интерес  представляют следующие вопросы:

1) как белки связываются с  мембранами? 2) какую роль играет  мембрана в активации участвующих  в свертывании крови ферментов?  Окончательных ответов на эти  вопросы пока нет.

Всем связывающимся с мембранами факторам свертывания крови необходимы кислые фосфолипиды. Некоторые из них, в частности факторы VII, IX, X и протромбин, требуют также Са²⁺. С участием витамина К происходит модификация этих четырех белков - карбоксилирование в ^-положении остатков глутамата, локализованных в гомологичных N-концевых участках каждого из полипептидов. В результате такой модификации в молекуле белка формируется значительное число высокоаффинных центров связывания Са^2 +, который в свою очередь необходим для соответствующего взаимодействия белков с кислыми фосфолипидами на мембране. Каким образом Са²⁺ облегчает белково-мембранные взаимодействия, не совсем ясно. Это может быть, в частности, "сшивание" с помощью Са²⁺белка с гидрофильными отрицательно заряженными головками фосфолипида. Кальций необходим не для всех факторов свертывания крови. Так, фактор V может непосредственно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфолипидами, а другой компонент, так называемый "тканевый фактор", вообще является интегральным мембранным белком. Большей частью, однако, факторы взаимодействуют с поверхностью бислоя за счет электростатических сил, хотя иногда наблюдается и некоторое проникновение белка в гидрофобную область мембраны.

Присутствие фосфолипидов сильно меняет стационарную кинетику реакций протеолитической активации. Резко уменьшается значение Км для белкового субстрата; например, для реакции активации фактора X фактором 1Ха Км изменяется от 181 до 0,058 мкМ. Добавление другого белка, фактора Villa, увеличивает K_ma* более чем в 200 000 раз. Поскольку реакция катализируется обоими ферментами, а субстрат в данных условиях измерения представлен как мембраносвязанной, так и свободной формами, истинный механизм влияния липида в таких реакциях определить чрезвычайно сложно. Например, показано, что протеолитическая активность фактора X увеличивается при связывании его с мембраной, в то время как фактор IX одинаково активен в свободном и в мембраносвязанном состояниях. Фактор X можно также активировать комплексом фактора Vila и тканевого фактора. В этом случае протеолитическая активация фактора X происходит, только когда он находится в свободной форме в растворе и не связан с мембраной. Другой пример - активация протромбина фактором Ха. Наблюдаемое в этом случае низкое значение Км коррелирует с концентрацией субстрата и протромбина на поверхности фосфолипидной везикулы. Если же добавить кофактор - фактор Va, образующий с фактором Ха комплекс, - то всякая зависимость Км от поверхностной концентрации протромбина на везикуле исчезнет. В заключение отметим, что данная система очень сложна, и роль липидов здесь отнюдь не сводится лишь к созданию соответствующей поверхности, на которой происходит простое концентрирование компонентов системы.

Факторы свертывания крови входят в группу Са^2 +-зависимых липидсвязывающих белков. Функции этих белков не всегда бывают известны; некоторые из них связаны с цитоскелетом. Фосфолипазы, к рассмотрению которых мы сейчас перейдем, также являются Са^2 +-зависимыми ферментами.

6.6 Фосфолипазы - растворимые  ферменты, катализирующие расщепление  мембраносвязанных субстратов

Фосфолипиды служат субстратами многих растворимых ферментов, в том  числе фосфолипаз. Среди них лучше  всего изучена фосфолипаза Аг, которая катализирует гидролиз фосфолипидов по положению sn-2 с образованием жирной кислоты и лизофосфолипида. Фосфолипаза  Аг была выделена сначала из ядов кобры  и гремучей змеи, а затем из поджелудочной  железы быка и свиньи. Это очень  близкие по первичной структуре  небольшие белки с мол. массой около 14 000. Для некоторых ферментов  удалось получить с высоким разрешением  трехмерные структуры, также обладающие высокой степенью гомологии. Ферменты из поджелудочной железы синтезируются  как неактивные зимогены, которые  затем активируются протеолизом: от зимогена отщепляется семь остатков с С-конца.

Фосфолипаза Аг представляет особый интерес с точки зрения мембранной энзимологии, поскольку она обладает способностью активироваться при взаимодействии с интегрированными формами субстрата, например с мицеллами или бислоем. На Рис.6.8 представлена зависимость  от концентрации субстрата скорости гидролиза короткоцепочечного фосфатидилхолина фосфолипазой Аг и его предшественником из поджелудочной железы свиньи.

Данный субстрат в концентрациях  до 1,5 мМ является мономером, но при  дальнейшем увеличении концентрации формирует  мицеллы. И зимоген, и активированный фермент очень медленно гидролизуют  субстрат в мономерной форме, но как  только фосфолипид начинает образовывать мицеллы, активность фосфолипазы А₂ резко возрастает.

Активации фосфолипазы агрегированными  субстратами было посвящено множество  работ, а которых исследовалась  кинетика катализируемого ферментом  гидролиза субстратов в мономерной форме, в чистых липидных мицеллах, в смешанных мицеллах с тритоном Х-100, в монослоях на поверхности  раздела воздух-вода и в фосфолипидных везикулах. Для проявления каталитической активности ферменту во всех случаях нужен Са^2 +, причем центр связывания единственного иона Са²⁺ можно выявить с помощью рентгеноструктурного анализа. В отличие от факторов свертывания крови фосфолипаза Аг не содержит остатка - у-карбоксиглутаминовой кислоты и для ее активации не требуются кислые фосфолипиды.

Для объяснения механизма активации  фосфолипаз предложено несколько гипотез