Мембранная энзимология

Для исследования влияния липидов  на мембранные ферменты применяется  еще одна стратегия - так называемый метод смешанных мицелл. Фермент  растворяют в детергенте, не активирующем его, и к смеси добавляют липиды. Многие мембранные ферменты сохраняют определенную активность и в детергенте, причем такая активность сильно зависит не только от природы фермента, но и от выбранного детергента, а также, возможно, от наличия эндогенных липидов в препарате очищенного фермента. Вообще говоря, для метода смешанных мицелл желательно полностью освободить фермент от липида, однако для этого иногда приходится использовать весьма грубые процедуры, которые могут привести к денатурации белка. Методы полного обезжиривания обычно основаны на пропускании препарата фермента через среду с большим избытком детергента. Для этого используют гель-фильтрацию, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или связывание фермента с каким-либо твердым носителем с последующим промыванием избытком детергента.

Метод смешанных мицелл имеет еще  и то преимущество, что липофильный  субстрат можно добавить в мицеллах того же детергента, хотя в этом случае могут возникнуть трудности, связанные  с пространственным разделением  фермента и субстрата. Наблюдаемые  в такого рода системах эффекты липидов  являются преимущественно аллостерическими, поскольку здесь нет бислоя, а  связывание липидов с белком происходит в глобулярной мицелле в присутствии  большого количества детергента. К  сожалению, физическое состояние комплекса  фермент-детергент-фосфолипид определить практически невозможно, и это  серьезный недостаток описываемого подхода.

Любые эффекты, наблюдаемые в такой  системе для какого-либо липида, должны быть получены с использованием нескольких не активирующих фермент  детергентов. Только в этом случае можно  быть уверенным, что детергент нейтрален. К сожалению, такие работы встречаются  не часто.

Результаты исследования многих систем позволяют сделать несколько  общих выводов.

Для активации фермента очень редко  бывает необходим липид с какой-то строго определенной структурой. Безусловно, одни липиды активируют данный фермент  с большей эффективностью, чем  другие, однако такое предпочтение может зависеть от условий измерения, а уж говорить о его физиологическом  значении как минимум преждевременно. Вполне может оказаться, что липид, с высокой эффективностью активирующий фермент, вообще не присутствует в мембране, из которой этот фермент выделен. Поэтому к утверждениям о специфичности  липида следует относиться с. осторожностью.

Измеряемая в системе со смешанными мицеллами зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации липида обычно свидетельствует о  высокой кооперативности процесса. Такое поведение можно объяснить, в частности, тем, что липиды связываются  некооперативио с несколькими эквивалентными центрами на ферменте, но активными  являются только те молекулы фермента, у которых занята большая часть  липидсвязывающих центров. Нередко  при активации фермента липидом  наблюдается оптимум в концентрационной зависимости, вероятно связанный с  достижением определенного соотношения  между липидом и детергентом  и образованием в такой смеси  конкретных структур.

Сама по себе бислойная структура  не является необходимой для активации  ферментов, поскольку многие ферменты проявляют активность в присутствии  детергента или в составе липидио-детергентных мицелл. Известны случаи, когда мембранные ферменты эффективно активируются липидами, вообще не формирующими стабильные бислои.

Важным параметром, определяющим активность большинства мембранных ферментов, безусловно является физическое состояние  бислоя. Однако четких данных о физиологической  регуляции ферментативной активности с помощью этого параметра in vivo нет. При переходе липидов в фазу геля многие ферменты становятся неактивными  либо их активность резко уменьшается. В литературе есть масса примеров, когда изменения скорости работы фермента с температурой коррелировали  с изменением физического состояния  липидов. В этих работах основное внимание обращалось на корреляцию между  точками перегиба в температурных  зависимостях ферментативной активности и какой-либо характеристикой, отражающей физическое состояние липида. Выявить  связь ферментативной активности с  вязкостью мембраны, исходя из температурной  зависимости, весьма непросто, поскольку  температура влияет одновременно на очень многие параметры. Следует  иметь в виду, что вязкость мембраны в значительной степени коррелирует  с плотностью упаковки молекул липида в бислое, и индуцируемые температурой изменения вязкости можно объяснить  в основном изменениями в плотности  упаковки. Существует очень немного  примеров четкой линейной корреляции между активностью фермента и  вязкостью мембраны. Неясно, правда, как интерпретировать эту корреляцию с точки зрения механизма ферментативной реакции. И лишь в нескольких работах  содержатся указания на то, какая или  какие из стадий ферментативной реакции  являются лимитирующими и модулируются связыванием липида. В связи с  этим необходимо упомянуть, что липиды могут сильно влиять не только на максимальную скорость, но и на связывание фермента с субстратами и кофакторами.

Вообще говоря, при исследовании взаимодействия с определенным ферментом  большого числа разных липидов корреляции между активностью фермента и  каким-либо одним параметром не наблюдается. Пока липид находится в жидкокристаллическом состоянии, для ферментативной активности часто более важна структура  полярной головки липида, чем вязкость бислоя. Другими словами, важна химическая структура индивидуальных липидов, а почему - это уже отдельный  вопрос.

4. Некоторые примеры липидзависимых  ферментов

Рассматриваемые ниже пять ферментов  выбраны в качестве примеров потому, что, во-первых, они лучше всего  изучены и охарактеризованы; во-вторых, они охватывают несколько типов  мембранных ферментов; в-третьих, они  могут служить иллюстрацией нескольких основных проблем, возникающих при  исследовании липидзависимой активации.

4.1 0-гидроксибутиратдегидрогеназа

Это один из наиболее хорошо изученных  активируемых липидом ферментов  и единственный фермент, обладающий абсолютной специфичностью к определенному  липиду: активировать БДГ способен только фосфатидилхолин. БДГ локализуется на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и катализирует окисление /3-гидроксибутирата с помощью NAD⁺. Оба субстрата водорастворимы. Молекулярная масса субъединицы фермента равна 31 кДа, но ее аминокислотная последовательность до конца не установлена. БДГ скорее всего не является трансмембранным белком. Получаемый после очистки фермент свободен от фосфолипида и детергента и способен спонтанно встраиваться в фосфолипидные везикулы. Хотя БДГ связывается и с везикулами, не содержащими Фосфатидилхолина, каталитическую активность фермент начинает проявлять только в присутствии фосфатидилхолина. При встраивании фермента в везикулу, по-видимому, происходит не только взаимодействие с поверхностью мембраны, но и значительное погружение белка в бислой, а также изменения конформации белка. Кинетические свойства фермента и его тетрамерной формы одинаковы в митохондральной мембране и после реконструкции с митохондриальными липидами.

На Рис.6.2 приведена кривая активации  БДГ фосфолипидными везикулами, содержащими  разное количество фосфатидилхолина. Во всех случаях фермент встроен  в липосомы. Зависимость скорости ферментативной реакции от содержания фосфатидилхолина в бислое указывает  на высокую кооперативность процесса, в котором участвуют два необходимых  для активации липидсвязывающих центра.

Кроме того, по данным о тушении  флуоресценции триптофана производными фосфатидилхолина отдельно была определена доступность молекул фосфатидилхолина для БДГ. Степень тушения флуоресценции  фактически является мерой связывания липида. Оказалось, что фосфатидилхолин  связывается некооперативно с примерно 12 центрами в молекуле фермента. Такое  некооперативное связывание с довольно большим числом центров весьма типично  для мембранных белков в бислое. Кроме того, основная часть флуоресценции тушится при более низких концентрациях фосфатидилхолина, чем необходимо для активации. Такое расхождение между связыванием липида и активацией фермента можно объяснить, если предположить, что в активации участвует только очень небольшая часть центров, которые не удается выявить в экспериментах по тушению флуоресценции. Приведенные результаты интересны еще и тем, что позволяют сопоставить физическое взаимодействие определенного липида и фермента с биохимическим ответом.

Интерпретация результатов таких  экспериментов осложняется тем, что активность фермента может сильно зависеть от степени его агрегации, т.е. активность фермента в различных  липидах, по-видимому, будет соответствовать  степени его дезинтеграции. БДГ  замечателен еще и тем, что  это один из немногих ферментов, активируемых короткоцепочечными гомологами фосфатидилхолина, которые связываются с ферментом  и активируют его в концентрациях  ниже критической концентрации мицеллообразования. Эти данные тоже подтверждают, что  в активацию липидом вовлечено  только небольшое число центров  связывания на белке.

4.2 Пируватоксидаза

Эта флавиносодержащая дегидрогеназа  из Е. coli, катализирующая окисление  пирувата до уксусной кислоты и СОг  и восстановление убихинона в  цитоплазматической мембране, обеспечивает поступление электронов в аэробную дыхательную цепь. Фермент обладает рядом замечательных особенностей. Он растворим в воде и не проявляет  никаких характерных для мембранного  белка свойств. Однако в присутствии  субстрата и кофактора происходит изменение конформации белка, в  результате чего формируется центр  связывания с мембраной. В этих условиях резко возрастает сродство фермента к детергентам и фосфолипидным  везикулам, и белок по своим свойствам  становится похож на истинный мембранный фермент. Пируватоксидаза может  служить примером фермента, который  является цитоплазматическим, пока субстрата  мало, но превращается в мембранный, как только концентрация субстрата  становится достаточно высокой.

Наибольший интерес при исследовании этого фермента представляла его  эффективная активация липидами. Активность фермента можно измерить, используя вместо природного мембраносвязанного акцептора - убихинона какой-либо растворимый  в воде искусственный акцептор электронов, например феррицианид. В присутствии  липидов каталитическая активность пируватоксидазы возрастает до 50 раз. В отличие от /3-гидроксибутиратдегидрогеназы этот фермент активируется самыми разнообразными фосфолипидами и детергентами. В  концентрациях ниже критических  концентраций мицеллообразования фермент  полностью активируется как анионными, так и катионными детергентами, а  исследование связывания детергентов  показывает, что в активации участвует  очень небольшое число центров  связывания. Связывание фермента с  фосфатидилхолиновыми везикулами или  детергентами не происходит до тех  пор, пока не добавлены субстрат и  кофактор. В присутствии субстрата  и кофактора пируватоксидаза  способна связываться и активироваться разнообразными везикулами, полученными из целого ряда фосфолипидов. Связывание происходит в первую очередь за счет гидрофобных, а не электростатических взаимодействий. Связывание липида и активация в случае пируватоксидазы, по-видимому, неразделимы, хотя и не все везикулы связываемого фосфолипида или амфифильного соединения ответственны за активацию фермента. Активация липидами вызывает изменения в спектре поглощения связанного флавина, вероятно, вследствие облегчения реакции переноса электронов.

Конформационные изменения в молекуле пируватоксидазы приводят не только к образованию липидсвязывающего  домена, но и к появлению чувствительного  к протеазам участка цепи вблизи С-конца. Протеолиз подавляет связывание липидов, но, как это ни удивительно, вызывает активацию фермента в отношении  реакции восстановления водорастворимых  искусственных акцепторов электронов. Активированный протеазами фермент, однако, уже не может восстанавливать  мембраносвязанный убихинон, поскольку  утрачивает способность связываться  с мембраной.

Как показывают результаты клонирования и секвенирования гена, кодирующего  пируватоксидазу, аминокислотная последовательность белка не имеет протяженных гидрофобных  участков. Генетические исследования, а также данные по протеолизу показали, что за связывание липида ответствен участок полипептида, локализованный вблизи С-конца. В этом участке имеется  короткая потенциально амфифильная  а-спираль, которая и может участвовать  в связывании с поверхностью бислоя. Получен мутантный штамм Е. coli, у которого пируватоксидаза лишена последних 24 аминокислотных остатков. Такой фермент полностью неактивен in vivo, но in vitro успешно катализирует реакцию с водорастворимым акцептором электронов. Предположительно такой  мутантный вариант пируватоксидазы  не способен связываться с мембраной  даже при высоких концентрациях  субстратов, а значит, не может осуществлять катализ, поскольку для этого  фермент должен окисляться убихиноном. Приведенное исследование является хорошим примером того, как данные по связыванию липида и активации, полученные in vitro, могут с успехом применяться  для объяснения механизма функционирования фермента в клетке.

И пируватоксидаза, и /3-гидроксибутиратдегидрогеназа могут активироваться либо 1) при  связывании с небольшим числом молекул  амфифильного соединения, либо 2) при  связывании с поверхностью бислоя. В последнем случае некоторая  часть белка проникает в глубь  мембраны. Оба рассмотренных примера  четко иллюстрируют роль фосфолипидов как аллостерических регуляторов.

4.3 Са^2 + - АТРАза

Если предыдущие два примера  иллюстрируют роль липидов как аллостерических  эффекторов мембранных белков, то Са^2 + - АТРаза и еще два фермента, рассмотренные ниже, являются примерами ферментов, на активность которых влияют структура липида и физическое состояние бислоя. Выделенная из саркоплазматического ретикула скелетных мышц Са²⁺ - АТРаза состоит из единственной полипептидной цепи с мол. массой 115 кДа. Фермент осуществляет активный транспорт Са²⁺ внутрь саркоплазматического ретикулума, уменьшая тем самым концентрацию Са^2 + в цитоплазме во время релаксации мышцы. На каждую гидролизованную молекулу АТР через мембрану переносятся два иона Са^2 +, и реакция является электрогенной, т.е. перенос зарядов через бислой создает трансмембранный электрический потенциал. По результатам секвенирования соответствующего гена установлена аминокислотная последовательность белка. Предполагается, что полипептид имеет 10 трансмембранных спиральных участков.

В мембране саркоплазматического ретикулума фермент, по-видимому, образует димеры, но мономерная форма в мицеллах детергента сохраняет основные кинетические свойства. С помощью процедуры дезоксихолатного диализа очищенная Са^2 + - АТРаза может быть успешно встроена в везикулы. В некоторых препаратах реконструированный фермент образует более крупные агрегаты, чем димеры, хотя физиологическое значение этого процесса неясно.