Мембранная энзимология

В ряде лабораторий изолированный  фермент был полностью обезжирен  и реконструирован с целым  рядом липидов и липидных смесей. На Рис.6.3 представлена зависимость  активности АТРазы от количества связанного с ферментом липида в отсутствие детергентов. Из приведенных данных видно, что для полной активации  на одну молекулу АТРазы должно приходиться 30 молекул фосфолипида; этого количества, по оценкам, достаточно, чтобы образовать вокруг каждой молекулы белка фосфолипидный  монослой. Столь прямолинейная интерпретация  этих данных, по-видимому, неправомочна, поскольку нам неизвестно физическое состояние такой смеси.

На основании результатов этой работы была предложена концепция пограничных, или аннулярных, липидов, т.е. липидов, непосредственно граничащих с белком. Критическим фактором, определяющим ферментативную активность, согласно этой концепции, должен быть липидный состав этого аннулярного слоя. Отсутствие влияния холестерола, включенного  в фосфолипидно-белковые комплексы, предполагает, что холестерол не включается в аннулярный слой, однако соответствующие  данные по связыванию холестерола показали, что это не так. Вообще говоря, на основании одних лишь кинетических данных понять механизм связывания липида довольно трудно.

В нескольких работах было достоверно доказано, что выше температуры фазового перехода липида отсутствует корреляция между вязкостью или параметром упорядоченности бислоя и ферментативной активностью. В регуляции ферментативной активности более важную роль, безусловно, играет структура самого липида, чем  любой отдельно взятый параметр, отражающий физическое состояние бислоя. Но почему одни липиды активируют встроенные в  везикулы ферменты лучше, чем другие, пока неизвестно.

4.4 Na⁺/K⁺ATPA3a

Этот фермент катализирует АТР-зависимый  транспорт ионов Na⁺ и К⁺ через плазматическую мембрану животных клеток. На каждую молекулу гидролизованного АТР из клетки выводятся три иона Na ⁺ и поступают два иона К ⁺. Фермент является электрогенным ионным насосом, генерирующим трансмембранный потенциал. Na ⁺/К ⁺-АТРаза выделена в чистом виде из нескольких источников. Она всегда состоит из двух суъединиц: большой каталитической субъединицы и малой, представляющей собой гликопротеин. Функция /3-субъ-единицы неясна. Полные аминокислотные последовательности обеих субъединиц известны для Na⁺/К⁺-АТРазы из почек овцы и из электрического органа ската Torpedo californica. Каталитическая субъединица гомологична Са ⁺ - АТРазе и также образует значительное число трансмембранных спиральных участков. /З-Субъединица, по-видимому, также пересекает мембрану; вероятно, трансмембранным является и единственный спиральный сегмент.

Функционирующей формой фермента, по-видимому, является либо гетеродимер а/3, либо тетрамер г; исследователи пока не пришли к единому мнению относительно минимальной  единицы, необходимой для ионного  транспорта. Очищенный фермент удается  реконструировать с целым рядом  фосфолипидов, но для восстановления активности наиболее эффективны фосфатидилсерин  и фосфатидилглицерол. Причина этого  неясна, но показано также, что фермент  в бислое несколько лучше связывается  с кислыми фосфолипидами. Липидное окружение влияет не только на каталитическую активность, но и на чувствительность фермента к специфическому ингибитору уабаину.

Для реконструкции Na⁺ /К ⁺ - АТРазы в первую очередь важна структура полярных головок фосфолипидов, но определенную роль, по-видимому, играет и вязкость бислоя. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов по изменению с увеличением гидростатического давления вязкости липидов в содержащих фермент препаратах плазматической мембраны. Высокое давление стабилизирует систему в конфигурации с минимальным объемом. Поэтому с увеличением гидростатического давления свободный объем и вязкость бислоя уменьшаются. Как видно из рис, 6.4, между ферментативной активностью и вязкостью мембраны, измеряемой по степени анизотропии флуоресценции мембранных зондов, наблюдается четкая корреляция. Авторы полагают, что изменение свойств бислоя при повышении давления приводит к стабилизации определенных конформационных состояний фермента в ходе каталитического цикла, что влияет на лимитирующую стадию суммарной реакции.

Нельзя, однако, исключить и иное объяснение: давление влияет на фермент  прямо, а не опосредованно через  липид. Впрочем, эти эксперименты важны  уже тем, что показывают возможность  изменения физического состояния  мембраны под действием гидростатического  давления.

4.5 Переносчик глюкозы

Поразителен, однако, тот факт, что  на максимальную скорость работы этого  переносчика вообще не влияет температурный  фазовый переход липида из жидкокристаллического  состояния в гель.

5. Мембраносвязанные электротранспортные  цепи

В большинстве работ, посвященных  мембранным ферментам, исследовались  компоненты различных мембранных систем электронного транспорта. Эти системы  выполняют весьма важные биохимические  функции, а их компоненты содержат окрашенные простетические группы, что позволяет  следить с помощью спектрофотометрического  метода за кинетикой их редокс- или  конформационных превращений как  в нативной мембране, так и после  выделения и очистки отдельных  ферментов. Здесь мы рассмотрим четыре основные злектронтранспортные системы, схематически изображенные на рис. 5. Это:

1) участвующая в биосинтезе стероидов,  содержащая цитохром Р450 система  митохондрий коры надпочечников;

2) система микросомного окисления,  включающая множество цитохромов  Р450, а также цитохром bs \ 3) дыхательная  цепь митохондрий;

4) фотосинтетическая система тилакоидов  зеленых растений. Все четыре  системы являются основными белковыми  компонентами мембран, в которых  они локализованы, и могут служить  иллюстрацией различных уровней  организации мультиферментных комплексов  в мембранной энзимологии. Первые  две системы катализируют анаболические  и катаболические реакции, протекающие  в присутствии молекулярного  кислорода и обычно липофильных  мембраносвязанных субстратов. Терминальные  ферменты этих электронтранспортных  цепей, цитохром Р450 и десатураза  жирных кислот, характеризуются  очень низким числом оборотов. Системы и являются основными  электронтранспортными ансамблями  энергетического обмена, первичная  функция которых состоит в  переносе протонов через мембрану. Генерируемый при этом градиент  электрохимического потенциала  протонов используется для синтеза  АТР. В отличие от микросомной  и митохондриальной систем цитохрома  Р450, дыхательная и фотосинтетическая  цепи катализируют трансмембранные  реакции и характеризуются довольно  высоким числом оборотов, 200-300 с  " ¹. В приведенном ниже кратком обзоре основное внимание обращается на частные вопросы, интересные с точки зрения энзимологии, отмечаются некоторые общие черты, а также представляющие особый интерес дискуссионные моменты.

При рассмотрении любой из этих систем, естественно, возникает вопрос: до какой  степени могут взаимодействовать  друг с другом различные мембраносвязанные  компоненты этих электронтранспортных цепей, с тем чтобы образовались долгоживущие комплексы? Теоретическое  рассмотрение вероятности ассоциации мембранных белков показывает, что  наиболее важны следующие факторы:

1) высокая концентрация реакционноспособных  белков из-за ограниченности мембранного  пространства;

2) заранее заданная ориентация  белков, поскольку они могут вращаться  лишь в плоскости, параллельной  плоскости мембраны; вращение перпендикулярно  поверхности бислоя запрещено;

3) исключенный объем, связанный  с наличием в мембране других  белков, что приводит к еще  большему концентрированию компонентов  этих систем.

5.1. Система синтеза стероидов  в митохондриях

Выделяемые надпочечниками стероидные гормоны, такие, как кортизон, синтезируются  из холестерола в ходе реакций, катализируемых ферментами, которые локализованы в  митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. При этом промежуточные  продукты метаболического пути должны "курсировать" между данными  органеллами. Реакции катализируются мембраносвязанными гемсодержащими белками - цитохромами Р450. Название этой большой  группы ферментов связано с тем, что максимум их поглощения приходится на длину волны 450 нм. Эти ферменты являются оксидазами со смешанной функцией; в катализируемой ими реакции  происходит расщепление молекулы кислорода, при этом один атом кислорода включается в состав молекулы воды, второй - в  субстрат. В биосинтезе стероидов  участвуют четыре цитохрома Р450. Два находятся в митохондриях, два - в эндоплазматическом ретикулуме ткани. Необходимые для реакции электроны поступают в систему через относительно простую электронтранспортную цепь.

В митохондриях коры надпочечников  источником электронов для синтеза  гормонов является NADPH, который восстанавливает  флавопротеин и ферредоксин. Эти  белки локализованы на матриксной стороне  внутренней митохондриальной мембраны. Два цитохрома Р450, P450_scc и Р450п#, являются интегральными мембранными ферментами, способными взаимодействовать с мембраносвязанными субстратами. Адренодоксин-редуктаза, возможно, частично погружена в бислой, но легко отделяется от мембраны. Адренодоксин - это низкомолекулярный рао" творимый белок, он переносит электроны от флавопротеи" на к цитохромам Р450. Взаимодействие адренодоксина с редуктазой и цитохромами Р450 осуществляется главным образом с помощью ионных взаимодействий. Вероятно, с обоими реакционными партнерами адренодоксин связывается с помощью одного и того же домена. Такой же способ передачи электронов между двумя мембранными ферментами при участии небольшого растворимого белка можно обнаружить и в дыхательной, и в фотосинтетической электронтранспортных системах. Связывание стероидных субстратов с цитохромами Р450 можно зарегистрировать по изменениям в спектре поглощения гема. Холе-стеролсвязывающий центр, по-видимому, экспонирован в гидрофобную область липидного бислоя. Показано также, что связывание холестерола более чем в 10 раз увеличивает сродство адренодоксина к цитохрому Р450.

Число оборотов адренодоксина гораздо  выше, чем двух указанных ферментов, поэтому одна молекула восстановленного адренодоксина может обеспечить электронами несколько молекул  цитохрома Р450. Указанная на Рис.6.5 стехиометрия компонентов при условии, что лимитирующим является функционирование цитохромов Р450, создает своеобразный эффект электронного каскада. Очевидно, что при таких обстоятельствах  три компонента этой простой системы  не смогут образовать единый суперкомплекс, да и вряд ли формирование такого комплекса  способствовало бы эффективному переносу электронов по цепи.

5.2 Микросомные электронтранспортные  цепи

Электронтранспортные цепи, локализованные на цитоплазматической поверхности  эндоплазматического ретикулума, участвуют  также в метаболических превращениях липофильных субстратов. Как видно  из Рис.6.5, существуют две такие системы, но, как недавно выяснилось, они  не являются независимыми. В одной  системе NADH окисляется флавопротеином цитохром fts-редуктазой, которая в  свою очередь через цитохромы  восстанавливает стеарил-СоА-десатуразу. В микросомах печени десатураза является индуцибельным ферментом. Вторая система  включает в себя окисление NADPH другим флавопротеином, цитохром Р450-редуктаз<цй, которая затем передает электроны  на целое семейство цитохромов Р450. Одни из этих цитохромов также являются индуцибельными, другие - конститутивными. Отметим, что в обеих системах число терминальных ферментов значительно  превышает число редуктаз в начале каждой цепи. Как и в Р450-содержащей системе митохондрий, число оборотов терминальных ферментов настолько мало, что небольшое число редуктаз вполне успевает обеспечить восстановительными эквивалентами все молекулы терминальных ферментов. Микросомная система не содержит каких-либо растворимых белковых компонентов, аналогичных адренодоксину; все ферменты представляют собой интегральные мембранные белки, их можно выделить из мембраны, очистить и исследовать в реконструированном виде.

В серии обстоятельных работ  Штритматтер с коллегами четко  показал, что цитохром />5-редуктаза  и цитохром bs распределены в мембране случайным образом и взаимодействуют  благодаря диффузии: эти два фермента диффундируют латерально по поверхности  мембраны, а перенос электронов происходит только во время их случайных столкновений. Такой механизм реализуется как  в реконструированных протеолипосомах, так и в микросомной мембране. Диффузия, однако, не является лимитирующим процессом. В норме в системе  имеется десятикратный избыток  цитохрома bs над редуктазой. Такой  избыток связанного с мик-Росомной мембраной экзогенного цитохрома bs кинетически эквивалентен эндогенному  пулу цитохромов bs. И цитохром bs, и  цитохром 65-редуктаза являются двухдоменными  белками, в которых глобулярный  растворимый домен связывает  простетическую группу, а единственный гидрофобный хвост заякоривает  белок в мембране. Гемсвязывающий и флавинсвязывающий домены сконструированы  таким образом, чтобы облегчить  перенос электрона от флавина  к гему при взаимодействии этих белков.

В более поздних исследованиях, однако, были получены серьезные указания на то, что часть цитохрома bs в  микросомах не диффундирует свободно, а по крайней мере временно образует стехиометрические комплексы с  цитохромами Р450 и, возможно, с NADPH-цитохром Р450-редуктазой. Таким образом, цитохром bs играет важную роль в работе электронтранспортной цепи, включающей по крайней мере некоторые  изоформы цитохрома Р450 из микросом печени.