Депарафінування зрізів проводили в такий спосіб: зрізи витримували в двох частинах ксилолу (по 3 хвилини в кожній), двох частинах ацетону (по 3 хвилини в  кожній). Зрізи, які вилучають із другого ацетона стають на повітрі  білісуватими в результаті того, що ацетон випаровується. На поверхню зрізу  наносили за допомогою піпетки 0,01% ацетоновий розчин 8-ТСХ. Через 1 хвилину промивали  дистильованою водою, занурювали в  гліцерин і розглядали під люмінесцентним мікроскопом. Для збудження люмінесценції застосовували світлофільтр ФС-1, а у якості захисного (окулярного) використали світлофільтр зі скла ЖС-18. На препаратах у цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася зернистість, яка люмінесціювала жовто-зеленим світлом [24-28].

    Для доказу специфічності цитохімічної реакції 8-ТСХ із цинком на де парафіновані зрізи наносили 0,1М розчин ЕДТОК і розчин ДЕДТКН або 0,1М розчин ДЕДТКН. При послідовній обробці зрізів 8-ТСХ, у них не виявлялося люмінесцентної реакції [20,24,28].

    Пояснюється це тим, що ЕДТОК і ДЕДТКН утворюють  із цинком нефлуоресцуючий комплекс. Обробка ЕДТОК і ДЕДТКН зрізів із люмінесцентною реакцією 8-ТСХ призводила до гасіння цієї реакції внаслідок  витиснення 8-ТСХ із комплексу з  цинком [29].

    Після обробки з хлороформом зрізів, позитивною реакцією 8-ТСХ повторне фарбування острівцевих клітин цим  реагентом не вийшло. Це явище пов’язано  із екстракцією 8-ТСХ-цинкового комплексу, який добре розчиняється у хлороформі, із клітин [30]. 

2. Цитохімічна реакція альдегідфуксину в панкреатичних  клітинах В

    Для цитохімічного визначення інсуліну в панкреатичних клітинах В шматочки підшлункової залози фіксували в рідині Буена. Рідину Буена готували шляхом змішування 15 мл насиченого розчину пікринової кислоти, 5 мл нейтрального формаліну, 1 мл льодяної оцтової кислоти. Тривалість фіксації – 24 години [20-24].

      Потім шматочки підшлункової  залози проводили через спирти  зростаючої міцності (70⁰, 80⁰, 90⁰, 96⁰, абсолютний спирти) – по 4 години в кожному. Абсолютний спирт отримували перемішуванням 96⁰ спирту з прокаленим мідним купоросом. Після цього шматочки залози витримували у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰ С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰ С). Далі шматочки підшлункової залози  заливали в парафін [23].

    Із  парафінових блоків підшлункової залози готували зрізи товщиною 5-10 мкм. Депарафінування  зрізів проводили шляхом їхньої обробки  у двох ксилолах (по 3 хвилини в  кожному), потім відбувалась обробка  в спиртах міцності, що знижується, (абсолютний спирт, 96⁰, 90⁰, 80⁰, 70⁰) – по 3 хвилини в кожному і промивали у водопровідній воді (5 хвилин) [25].

    Після цього зрізи поміщали в окислювач (до порудіння) і відновник (до знебарвлення). Окислювач готували безпосередньо  перед його застосуванням у такий  спосіб: змішували одну частину 2,5% розчину  перманганату калію, одну частину 5% розчину  сірчаної кислоти та 4 частини дистильованої  води. У відновник зрізи поміщали без попереднього їхнього промивання у водопровідній воді після окислювання. Відновником слугував 2,5% розчин щавлевої кислоти або бісульфату натрію до повного знебарвлення [23].

    Після відновлення зрізи промивали  в дистильованій воді протягом 5 хвилин та фарбували протягом 6 хвилин  розчином альдегідфуксину, у герметично зачиненій посудині. Барвник готували таким чином: розчиняли 250 мг альдегідфуксину  в 25 мл  70⁰ спирту, потім ще додавали 75 мл 70⁰ спирту і 1 мл льодяної оцтової кислоти. Після закінчення зазначеного строку фарбування зрізи витягали з посудини, на них наносили трохи крапель 96⁰ спирту. Зрізи промивали протягом 5 хвилин у водопровідній воді. Потім зрізи проводили через 96⁰ спирт (1-2 хвилини), абсолютний спирт (1-2 хвилини), два ксилоли (по 1-2 хвилині в кожнім) і занурювали в бальзам [29].

    На  препаратах в цитоплазмі панкреатичних  клітин В виявлялася синьо-фіолетова  зернистість. ЇЇ кількість слугувала  показником вмісту в клітинах гормону  інсуліну [30].

3. Дитизонова  реакція у панкреатичних клітинах В

    Для дослідження цитохімічного визначає мого цинку, шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин у  холодному ацетоні. Потім шматочки залози доводили до парафіну наступним  чином: витримували їх у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу  та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰С). Далі шматочки підшлункової залози заливали в парафін. Парафінові зрізи підшлункової залози готували товщиною 5-10 мкм. Депарафінування зрізів проводили наступним чином: обробка у двох ксилолах – по 3 хвилини у кожній, обробка у двох ацетон ах – по 3 хвилини у кожному. Промивали у дистильованій воді 5 хвилин [20-23].

    У випадку постановки цитохімічної реакції  дитизону використовували 0,2% (робочий) його розчин. Тривалість забарвлення  – 3 години. Розчин готували таким чином. У колбочку з притертою (яка герметично замикається) пробкою наливали 30 мл дистильованої води, додавали 0,6 мл 25% розчина гідроксиду амонію та 400 мг дитизону. Суміш перемішували на водяній  бані впродовж 10 хвилин при 70⁰С. Потім фільтрували через беззольний фільтр. Так як на фільтрі залишалась приблизно чверть наважки реагенту, що не розчинився, фільтрат представляв собою 1% водно-аміачний розчин дитизону. Це основний розчин фарбника. Його робочий розчин готували п’ятикратним розведенням дистильованою водою його основного розчину. По закінченні терміну забарвлювання препаратів, зрізи промивали у двох порціях дистильованої води (по 5 хвилин у кожній) і замикали в гліцерин-желатин. Зрізи розглядали під світловим мікроскопом. На препаратах у цитоплазмі острівцевих клітин тварин виявлялися гранули червоного кольору [22].

    Специфічність цитохімічної реакції дитизону перевіряли наступним чином. Обробка де парафінованих  зрізів 0,1М, що була проведена заздалегідь  розчином ЕДТОК, попереджувала отримання кольорової дитизонової реакції у панкреатичних острівцях. Пояснюється це явище тим, що ЕДТОК утворює з цинком безкольоровий комплекс. Цей реагент має більш високі константи стабільності комплексів із цинком, аніж дитизон. У результаті цього, останній не здатний відокремити цинк від комплексу із ЕДТОК і не здібний внаслідок цього забарвити клітини [23-27].

    Якщо  ЕДТОК обробляти зрізи, на яких уже  вийшла позитивна кольорова реакція  дитизона, проходило скоріше (протягом 1 хвилини) знебарвлення зрізів. Пояснюється  це явище також конкурентним взаємовідношенням  даної речовини із дитизоном. Володіє  більш високим константами стабільності комплексів із цинком, він легко  витискує дитизон у поєднанні  із цим металом.

    Нарешті, при обробці зрізів із кольоровою реакцією дитизону хлороформом продукт  цитохімічної дитизонової реакції  екстрагується зі зрізів, і при  повторній обробці дитизоном  зрізи не забарвлюються ним. Ці дані говорять на користь селективності  цитохімічної дитизонової реакції  із цинком. Для підвищення цієї селективності, ми використовували замість дистильованої  води 0,2% розчин ДЕДТКН [30]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    ЗАКЛЮЧЕННЯ

    Ендокринну  частину підшлункової залози складають  клітини епітеліального походження, які отримали назву острівців  Лангерганса і які складають  всього 1-2% маси підшлункової залози. В  острівцях розрізняють три типа клітин, які продукують гормони: α-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону; β-клітини, які виробляють інсулін; δ-клітини, які продукують соматостатин; α-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону; G-клітини, які виробляють гастрин; РР-клітини, які виробляють невелику кількість панкреатичного поліпептиду.

    Регуляція секреції гормонів клітин острівців, як і їх ефекти, взаємопов’язані, що дозволяє розглядати остівцевий апарат, як «міні-орган». Основним регулятором секреції інсуліну являється D – глюкоза, яка надходить з кров’ю. Глюкоза активує в β-клітинах специфічну цАМФ. Секрецію інсуліну викликають також гормони ШКТ, іони Са²⁺. В регуляції секреції інсуліну визначену роль грає і вегетативна нервова система. Блукаючий нерв і ацетилхолін стимулюють секрецію інсуліну, а симпатичні нерви і норадреналін гальмує секрецію інсуліну і стимулює викид глюкагону. Специфічним інгібітором продукції інсуліну є гормон δ-клітин підшлункової залози – соматостатин.

    Секреція  глюкогону стимулюється зниженням  рівня глюкози в крові, гормонами  ШКТ та зменшенням в крові іонів  Са²⁺. Клятини ШКТ, які продукують гормони являються своєрідним «пристроєм раннього оповіщення» клітин панкреатичних острівців про надходження поживних речовин в організм.

    Інсулін впливає на всі види обміну речовин, він сприяє анаболічним процесам, збільшує синтез глікогену, жирів та білків, гальмуючи ефекти багато численних  контрінсулярних гормонів. Глюкагон являється міцним контрінсулярним  гормоном і його ефекти реалізуються в тканинах через вторинного посередника  цАМФ. На відміну від інсуліну глюкагон підвищує рівень цукру в крові.

    Інсулін сприймається спеціальними рецепторами, які реагують на присутість цього  гормону в периферичній крові.

    Іннервація  підшлункової залози реалізується постгангліонарними симпатичними і парасимпатичними нервами, гілками блукаючого і спінальних нервів. Безпосередньо в острівцях  закінчуються постгангліонарні симпатичні і парасимпатичні волокна. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ

1. Физиология  человека: учебник для мед. вузов / [Авдеев С. Н., Айсонов З. Р., Водолажская М. Г., Гурфингель В. С., Дегтярев В. П., Кобрин В. И. и др]; под. ред. В. М. Покровского, Г. Ф. Коротько.- [2-е изд.].- М.: Медицина, 2003.- 656 с.
2. Држевецкая И. А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы: пособие для биологических специальностей университетов и институтов / Држевецкая И. А. – М.: Высшая школа, 1983. – 272 с.
3. Физиология человека / [Е. Б. Бабский, В. Д. Глебовский, А. Б. Когант, Г. Ф. Коротько и др.]; под ред. Г. И. Косицкого. – [3-е изд.].-М.: Медицина, 1985.-544 с.
4. Нормальна фізіологія / [В. І. Філімонов, В. С. Райцев, В. Г. Шевчук, Д. Г. Наливайко]; під ред. В. І. Філімонова.-К.: Здоров’я, 1994.-608 с.
5. Тепермен Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс / Дж. Тепермен, Дж. Тепермен ; пер. с анг. В. И. Кандрора; под ред. Я. И. Ажипы.- М.: Мир, 1989.-656 с.
6. Основы физиологии человека: учебник для высших учебних заведений, в 2-х томах / [В. Б. Брин, И. А. Вартанян, С. Б. Даниярова, Ю. М. Захарова и др.]; под ред. Б. И. Ткаченко.- Санкт-Петербург.: Международный фонд истории наук, 1994. Т.1-567 с..
7. Брин В. Б. Физиология человека в схемах і таблицях / Брин В. Б. - [2-е изд.]. – Ростов н/Д.: Феникс, 1999. -352 с.
8. Рафф. Г. Секреты физиологии / Рафф. Г. - [пер. с анг. Д. Абдурохманов, Г. Азбиль, Ю. Бородина, Д. Газизова, В. Деньгин, В. Ромаив].- М.: «Бином»- «Невский диалект», 2001.-448 с.
9. Губський Ю. І. Біологічна хімія: підручник / Губський Ю. І. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.
10. Эндокринология / [Айзенберт Д., Близард Р., Блюминг А., Брикман А., Брикс С., Бхасинг Ш., и др. ]; пер с анг., В. И. Кандрор, Э. А. Антух, Т. Г. Горлина; под ред., Н. Лавин. – М.: «Практика», 1999. – 830 с.
11. Комов В. П. Биохимия: учебник для вузов / В. П. Комов, В. Н.Шведов. – М.: Дрофа, 2004. – 638 с.
12. Ефимов А. С. Сахарный диабет: проблемы наших дней / А. С. Ефиров, Ю. В. Щербак – К.: Наукова думка, 1991. – 153 с.
13. Балуш Л. В., Ковалишин В. І., Ященко А. М. Гістохімічні та електронномікроскопічні дослідження підшлункової залози на тлі експериментального цукрового діабету // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. –Т. 8, № 1 – 2009.- С. 37-42.
14. Кот Л. Сучасні уявлення про біохімічні механізми патогенезу інсулінонезалежного цукрового діабету / Л. Кот, О. Богданова, Л. Остапенко // Вісн. НАН України. – 2008.- № 9. – С. 18-26.
15. Міськів І. Ф. Морфофункціональні зміни ендокринної частини підшлункової залози у щурів старечого віку при стрептозотоциновому діабеті / І. Ф. Міськів // Прикл. асп. морфології експер. і клін. досліджень: тези доп. наук.-прак. конф. – Тернопіль, 2008. – С. 85-86.
16. Иннервация поджелудочной железы // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – Т.6. - № 1. – 1996. – С. 35-39.
17. Berger A. What does zinc do ? // BMJ. - 2002. - Vol. 325, № 7372. - P. 1059.
18. Chausmer A.B. Zinc, insulin and diabetes // J.Am.Coll.Nutr. - 1998. - Vol. 17, № 2. - P. 109-115.
19. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / [Меньшиков В. В., Делекторская Л. Н., Золотницкая Р. П. и др.]; под ред., В. В. Меньшикова. – М.: Медицина, 1987, - 368 с.
20. Brocardo P.S., Pandolfo P., Taikahashi R.H., Rodrigues A.L., Dafre A.L. Antioxidant defenses and lipid peroxidation in the cerebral cortex and hippocampus following acute exposure to malathion and / or zinc chloride // Toxicology. - 2005. - Vol. 207, N2. - P. 283-291.
21. Григорова Н.В. Стан панкреатичних острівців мишей i щypiв при введені сульфату міді тваринам, отримавшим алоксан // Питання біоіндикації та екології. - Запорiжжя: ЗНУ, 2008. - Вип. 13, № 2. - С. 163-169.
22. Григорова Н. В. Клітинний метаболізм цинку при уведені тваринам солей важких металів на фоні іммобілізованого стресу // Вісник ЗДУ. – 2000. - № 2. – С. 194-196.
23. Миргородська К. П., Григорова Н. В. Вплив фізичного навантаження на вміст цинку та секреторного матеріалу в клітинах Панета та В-інсулоцитах старих мишей // Науковий вісник Ужгородського університету. – 2008. - № 22. – С.114-117.
24. Міськів В.А.,Левицький В.А. Особливості будови панкреатичних острівців на різних етапах онтогенезу //  Світ медицини  та біології. – 2009.- № 4. – С. 36-40.
25. Вивчення вмісту цинку та інсуліну в острівцевих клітинах при різному функціональному станіінсулярного апарату / Т.В. Берегова, Н.В. Григорова, Ю.В. Єщенко [та ін.] // Фізіологічний журнал. – 2007. – Т.53, №4. – С. 100-104.
26. Діабетогенна активність дитизону у тварин різних видів / Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко, Є. Ю. Гороховський [та ін.] // Вісник Запорізького національного університету. – 2009.- № 2.- С. 85-89.
27. Рівень АКТГ й інсуліну в крові при різному функціональному стані кортикотрофів аденогіпофізу та бета – клітин панкреатичних острівців / Т.В. Берегова , Ю.В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохіміяю – 2010.- № 2. – С. 7-11.
28. Mechanisims of stabilization of the insulin hexamer allosteric ligand interactions / S. Rahuel-Clermont,C. A. French, N. C. Kaarsholm [at al.] // Biochemistry. – 1997. – Vol. 36, N 19. – P.5837-5845.
29. Mutation of active site residues of insulin degrading enzyme alters allosteric interactions / E.S.Song,A.Daily, M.G. Fried [at al.] // J.Biol. Chem. – 2005. – №3. – P. 175-179.
30. Rosenfeld L. Insulin: discovery and controversy / L. Rosenfeld // Clin. Chem. – 2002. – Vol.48, №12. –Р. 2270-2288.