Фізіологія підшлункової залози

    Зв’язок між ШКТ і ендокринною тканиною підшлункової залози не являється одностороньою: острівці Лангерганса здатні генерувати необхідність сигналу (окрім гальмування секреції шлункового інгібіторного пептиду), вливаючи на актівність кишечного епітелію. Наприклад, соматостатин (секреція котрого δ-кліткинами стимулується майже всіми відомими активаторами секреції інсуліну) знижує всмоктування глюкози в ШКТ. В цьому може заключатися механізм зниження швидкості надходження поглинутих речовин в кров. Соматостатин, місцево секретуючий клітинами слизової ШКТ, виконують, ймовірно, аналогічну функцію паракринним шляхом [5]. 

4. Рецептори інсуліну

 
 

    Прийнята  гетеротетрамерна структура рецептору може бути зображена наступним чином: βЅ – ЅαЅ – ЅαЅ – Ѕβ; (загальна мол. маса 360 К).

    Субодиниця  α має мол. масу 125 К, β-90 К. Обидві субодиниці являють собою глікопротеїни з вуглеводною частиною на зовнішній стороні мембрани [5].

1.     Фософрилювання рецептору

 
 

    β-субодиниця рецептору інсуліну - це тирозинкіназа. При взаємодії          α-субодиниці з інсуліном кіназна активність β-субодиниці стимулюється і відбувається її аутофосфорилювання. Активована β-кіназа може фосфорилювати не тільки сама себе, але і різні інші білки. У зруйнованих клітинах у складі β-субодиниці фосфорилюється тільки тирозин, але в інтактних клітинах (під дією інсуліну), крім β-субодиниці активуються і інші кінази; в результаті цього фосфорилюються і залишки серину і треоніну [1,2].

    Ці  цікаві дослідження інтенсивно розвивалися  в багатьох лабораторіях, але так  і не було отримано задовільних відповідей на такі питання: 1) чи можна вважати фосфорилювання тирозину β-субодиниці необхідним етапом трансмембранної передачі сигналу, яка обумовлює всю або частину плейотропної реакції на інсулін, а якщо це так, то 2) яким чином це відбувається [5]?

    Існує багато даних про тісну кореляцію  біологічних ефектів інсуліну з фосфорилюванням β-субодиниць рецептору. Однак є й інші, які свідчать про те, що відповідна реакція на зв'язування інсуліну з рецептором відрізняється від наслідків фосфорилювання останнього. Але якщо навіть знехтувати цими даними і прийняти точку зору, згідно якої фосфорилювання служить важливим етапом ініціації складної клітинної реакції на інсулін, то все одно не можна відповісти на питання, яким чином це відбувається.

    Слід  зазначити, що фосфорилювання β-субодиниці не по тирозину, а по серину і треоніну, каталізується цАМФ-залежної протеїнкіназою. Це є гарним прикладом контррегуляції на молекулярному рівні, оскільки фосфорулювання β-субодиниці по серину і треоніну знижує спорідненість α-субодиниці до інсуліну. Іншими словами, підвищення концентрації цАМФ в клітині викликає інсулінорезистентність. Не можна забувати про те, що інсулін може знижувати продукцію цАМФ, прискорювати його руйнування фосфодіестерази і тим самим перешкоджати активації цАМФ-залежної протеїнкінази. β-субодиниця рецептору інсуліну служить маленькою ареною, на якій відбувається боротьба двох гормональних «гладіаторів» - інсуліну і глюкагону [5]. 

2.     Регулювання рецепторів

 
 

    Функціональна активність рецепторів піддається швидкій або хронічної (шляхом зміни їх спорідненості до ліганду) або тільки хронічної (шляхом зміни щільності рецепторів на мембрані) регуляції.

    Спорідненість рецепторів необов'язково змінюється паралельно чутливості до інсуліну, хоча це і може мати місце. Так, голодування призводить до парадоксального підвищення спорідненості та зниження чутливості і реактивності до інсуліну внаслідок пострецепторних змін [5].

    Оскільки  спорідненість рецепторів до інсуліну прогресивно знижується у міру збільшення концентрації гормону, то було висунуто припущення, що при взаємодії зайнятих рецепторів проявляється негативна кооперативність. Зараз же, коли відомо, що фосфорилювання β-субодиниць знижує спорідненість      α-субодиниці до інсуліну, можна думати, що негативна кооперативность може бути проявом фосфорилювання β-субодиниці.

    Інтерес до хронічної регуляції щільності або числа рецепторів виник після оригінальних досліджень Рота, Кана та їх співробітників по зміні популяції рецепторів інсуліну при експериментальному і клінічному ожирінні. Ці автори показали, що 1) на адипоцитах і моноцитах, отриманих від страждаючих ожирінням особин, перебуває менше інсулін-зв'язуючих ділянок, ніж на клітинах контрольних особин (без ожиріння), і 2) це зменшення числа рецепторів пов'язано з гіперінсулінемією. При зниженні маси тіла у тварин або людини кількість рецепторів інсулінуліну зростає до контрольного рівня.

    Згодом  було встановлено, що зайняті рецептори інсуліну (як і практично всіх інших пептидних гормонів і амінів) проникають у клітину шляхом ендоцитозу. Хоча при цьому клітиною захоплюється гормон-рецепторний комплекс, доля інсуліну і його рецепторів в клітині різна. Перший швидко розпадається (період напіврозпаду інсуліну становить 30 хв); деякі рецептори розпадаються за більший проміжок часу (період напіврозпаду близько 10 год), тоді як інші зберігаються, піддаються повторному процесінгу і знову вбудовуються в мембрану. Незважаючи на численні спроби зв'язати ендоцитоз інсулін-рецепторного комплексу з біологічною дією інсуліну, показано, що проникнення цього гормону в клітину зовсім не обов'язково для індукції багатьох його ефектів. Особливо це справедливо і для імітують дію інсуліну антитіл до рецепторів [5,6,8]. 

3.     Надлишок рецепторів

 
 

    Для багатьох, але не всіх тканин характерний феномен надлишковості рецепторів інсуліну, який полягає в тому, що максимальний біологічний ефект реєструється при взаємодії гормону лише з 2-5% ділянок, які зв’язують інсулін. Надлишок рецепторів дозволяє клітині реагувати на інсулін навіть при відносно низьких його концентраціях. Гепатоцити володіють невеликим надлишком рецепторів інсуліну, тобто біологічний ефект гормону і зайнятість рецепторів тут паралельні. Це, імовірно, обумовлено анатомічним розташуванням печінки на шляху венозного відтоку від підшлункової залози, тобто тим, що печінка піддається дії набагато більш високих концентрацій інсуліну, ніж клітини периферичних органів [5].

5. Іннервація  підшлункової залози

 
 

    Іннервація  підшлункової залози реалізується постгангліонарними симпатичними і парасимпатичними нервами, гілками блукаючого і спінальних нервів. Безпосередньо в острівцях  закінчуються постгангліонарні симпатичні і парасимпатичні волокна.

    Підшлункова залоза отримує парасимпатичну іннервацію в основному у складі заднього вагусного стовпа. Еферентні волокна закінчуються в інтрапанкреатичних гангліях, які організовані за принципом ентеральної або метасимпатичної частини автономної нервової системи. Основним ефектом стимуляції блукаючого нерва супроводжується підвищенням секреції інсуліну, що супроводжується гіпоглікемією. Збудження симпатичної нервової системи i введения адреналіну (або норадреналіну) призводить до підвищення рівня цукру в крові [16-18].

    Симпатична  іннервація підшлункової залози проходить  через черевний та брижовий ганглій. Постгангліонарні нейрони закінчуються на ацинарних клітинах, нейронах метасимпатичної  системи. Більш виражена на ендокринних клітинах та кровоносних судинах (Рис. 1.4).

    Місцева іннервація підшлункової залози дуже щільна. Практично кожень острівець  оточений елементами париацинального  сплетіння.

    Аферентація підшлункової залози здійснюється у  складі блукаючого та черевного нервів [16]. 

    

    Рисунок 1.4 - Іннервація підшлункової залози

    1-артерія  шлунково – дванядцятиперсної  кишки; 2-правий черевний нерв; 3-печінкова артерія; 4-правий вагус; 5-лівий вагус; 6-ліва шлункова артерія; 7-лівий черевний нерв; 8-селезіночні артерія; 9-внутрішня панкреатодунальна артерія; 10-верхня брижова артерія.

    Нерви проходять в спряжені зсудинами  і тільки після цього відвітвлення входять в тканину підшлункової залози. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1. Методики  дослідження рівня глюкози в  крові

1. Глюкозотолерантний тест

 
 

    Глюкозотолерантний  тест – лабораторий метод дослідження, який застосовується в ендокринології для діагностики порушення толерантності до глюкози (предіабет) і цукрового діабету [7].

    При проведенні глюкозо толерантного тесту  необхідно дотримуватися таких  умов:

    - досліджуваний протягом 3-х днів до проби повинні дотримуватися звичайного режиму харчування і дотримуватися звичних фізичних навантажень;

    - дослідження проводять вранці натщесерце після нічного голодування протягом 10-14 годин (в цей час не можна палити та приймати алкоголь);

    - під час проведення проби пацієнт повинен спокійно лежати або сидіти, не палити, не переохолоджуватися і не займатися фізичними навантаженнями;

    - тест не рекомендується проводити після та під час стресових ситуацій, після операцій та пологів, при запальних процесах, алкогольному цирозі печінки, гепатитах, під час менструацій, при захворюваннях ШКТ з порушенням всмоктування глюкози;

    - перед проведенням тесту необхідно виключити лікувальні процедури і прийом ліків;

    Невірно позитивні результати спостерігаються  при гіпоглікемії, дисфункції печінки, ендокринопатіях.

    Суть методу заключається в замірі рівня глюкози крої натщесерце, потім протягом 5 хвилин пропонується випити склянку теплої води, в котрій розчинена глюкоза (75 грамів). Через 30 хвилин, 1 годину та через 2 години знову заміряють рівень цукру в крові [19].

    Рівень  цукру в крові не менше 7,8 ммоль/л (через 2 години після навантаження глюкозою) вважається нормою. При рівні  більше 7,8, але не менше 11,0 ммоль/л  результат тесту оцінюють як порушення  толерантності до глюкози. При рівні  глюкози в крові більше 11,0 ммоль/л  результат оцінюється як наявність цукрового діабету [11,19]. 

2. Визначення  рівня цукру в крові за методом Хаггедорна-Йенсена

 
 

    Рівень  цукру за модифікованим методом Хаггедорна-Йенсена визначається за наступною методикою. В мікропіпетку набирають 0,1 мл крові й видувають в пробірку, що містить 5 мл 0,45% розчину сульфату цинку та 1 мл 0,1 н розчину гідроксиду натрію. Для рівномірного перемішування крові з сумішшю вміст кожної пробірки струшують. Далі пробірки поміщають в металевий штатив, який переносять на 3 хвилини на водяну баню з киплячою водою. По закінченні цього строку пробірки вилучають. Вміст кожної пробірки фільтрують в окрему широкогорлу пробірку, куди додають по 2 мл розчину червоної кров’яної солі. Пробірки поміщають в штатив, який поміщають на водяну баню з киплячою водою. Через 15 хвилин штатив з пробірками зняти з бані. В кожну пробірку налити по 3 мл потрійного розчину та 2 мл 3% розчину оцтової кислоти.

    Для готування потрійного розчину 1г йоду розчинити в 40 мл подвійного розчину, що являє собою суміш 2г сульфату цинку, 10г хлориду та 40 мл дистильованої води. Вміст пробірки титрують розчином гіпосульфату натрію й по таблиці, яку запропонували С.Д. Балаховський та І.С. Балаховський, на підставі даних титрування встановлювити концентрацію глюкози в крові в ммоль/л [19].

2. Методики  дослідження панкреатичних острівців

1. Цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних  клітинах В

 
 

    Для цитохімічного визначення цинку  шматочки підшлункової залози фіксували  протягом 12 годин в холодному  ацетоні (+4⁰С) та витримували по 15 хвилин в 2-х порціях ксилолу. Потім промивали шматочки протягом 30 хвилин в суміші 50% парафіну та 50% ксилолу при температурі 37⁰С. Із такої суміші (каши) шматочки переносили в один, потім в другий рідкий парафін. Тривалість інфільтрування в кожному парафіні – 1,5 години при 56⁰С. Потім шматочки заливали в парафін [20-25].

    Із  приготовлених блоків підшлункової залози готували парафінові зрізи товщиною 5-10 мкм. Зрізи фарбували 0,01% ацетоновим розчином 8-ТСХ після попереднього депарафінування. Парафінові зрізи  переносили прямо з ножа на предметне  скло, яке вкрите шаром яєчного  білка. Для цього за допомогою  скляної палички на предметне  скло наносили тонким шаром яєчний білок. Останній прожигали над полум’ям спиртівки. На шар яєчного білка  поміщали парафіновий зріз і прижимали  до предметного скла. Така процедура  забезпечувала найкращу фіксацію на предметному склі парафінового зрізу. Виключення розплавлення зрізу в  теплій воді перед виловлюванням  його на предметне скло покращує відтворюваність  результатів [22,24,26].