Шпаргалки по "Генетике"

 

 Кроме продуктов  генов cI, cII, cIII, cro, промоторных и  операторных участков существенную  роль в процессах регуляции  выражения генома фага λ играют  гены N, O, P, Q.

 

 Продукт гена N осуществляет  позитивный контроль транскрипции  всех остальных генов фага λ. При индукции профага, дефектного по гену N, с промотора PL транскрибируется только сам ген N, а с промотора PR — только ген его. При наличии продукта гена N с обоих промоторов транскрибируются длинные полигенные мРНК. Действие продукта гена N является примером аттенуаторного контроля (аттенуация — регуляция транскрипции на уровне терминации). Аттенуаторные участки закодированы в ДНК фага λ между генами N и CIII, между генами его и CII, а также между генами P и Q. Именно в этих точках обрывается синтез мРНК при отсутствии продукта гена N.

 

 Под контролем группы  генов C, генов его и N находится  выражение, так называемых, ранних  белков, участвующих в рекомбинации  фаговой ДНК (int, xis, red, rex), регуляторных  белков (cI, cII, cIII, cro, N), белков, участвующих в репликации фаговой хромосомы (С, Р). Ни один из этих белков не относится к компонентам зрелой фаговой частицы.

 

 Структурные компоненты  фага кодируются поздними генами, расположенными справа от гена Q. Их выражение начинается после  того, как пройдет 1/3 латентного периода. Выражение поздних генов находится под позитивным контролем продуктов генов О, P, Q. Поздние гены транскрибируются в виде единой полигенной мРНК. При отсутствии продуктов генов O и P фаговая ДНК не реплицируется и не синтезируются продукты поздних генов.

 

58)

Трансдукция

 

 При изучении бактериофагов  было открыто явление, получившее  название трансдукция — перенос  фагом генов бактерии-хозяина  от клетки к клетке. Различают  специфическую и неспецифическую  (общую) трансдукцию.

 

 Специфическая трансдукция  впервые описана Ледербергом  и его сотрудниками на примере  колифага λ.. Они проводили заражение  различных типов ауксотрофных  мутантов штамма E. coli K12 фагом λ,  выращенном на исходном прототрофном  штамме K12. Чтобы проверить, не передались ли с помощью бактериофага ауксотрофам гены штамма дикого типа, культуры высевали на селективные среды. Результаты были в основном отрицательные, ни один из признаков донора не передавался фагом λ лизогенизированным реципиентам. Было лишь одно исключение — бактерии gal- (не способные утилизировать галактозу) с вероятностью 10-6 приобретали от донорского штамма признак gal+. Таким образом, было установлено, что фаг λ способен переносить (трансдуцировать) гены, но трансдукция носит специфический характер и ограничивается только генами gal, так как ДНК фага λ интегрирует в бактериальную хромосому в непосредственной близости от гена gal. С определенной вероятностью при выщеплении профага λ из состава бактериальной хромосомы происходит ошибка, и наряду с генами фага выходит область gal-гена E. coli, а часть фаговых генов остается в хромосоме. Трансдуцирующий фаг λ (λ gal) является дефектным. От 1/4 до 1/3 его генома замещается на область gal бактериальной хромосомы. Такие фаги не способны к вегетативному размножению, не образуют негативных колоний на газоне чувствительных бактерий. Однако при попадании в клетку хозяина, они делают ее устойчивой к повторной инфекции фагом λ. Дефектный фаг размножается и дает структурно полноценное потомство только при наличии фага-помощника (нормального фага λ, присутствующего в клетке-хозяине одновременно с дефектным). Такое возможно при одновременном инфицировании бактерии, как дефектным по гену gal, так и нормальным, диким фагом λ.

 

 

Неспецифическая (общая) трансдукция была описана Ледербергом и Татумом несколько раньше, чем специфическая. Это явление было открыто неожиданно, при попытке изучить половой процесс у Salmonella typhimurium. Для этого был использован метод, ранее позволивший продемонстрировать коньюгацию у E. coli. На синтетическую среду, содержащую только соли и углевод как источник углерода и энергии и не содержащую аминокислот, высевали смесь двух ауксотрофных мутантов S. typhimurium. Один из них нуждался для роста в фенилаланине, триптофане, тирозине (Phe-, Trp-, Tyr-), другой — в метионине и гистидине (Met-, His-). Одна из 100 000 колоний образовывала прототрофные колонии. Они являлись результатом генетической рекомбинации этих двух штаммов, в котором объединились аллели дикого типа Phe+, Trp+, Tyr+ от одного штамма и Met+, His+ — от другого. Был сделан вывод, что у Salmonella, как и у Escherichia, может происходить генетический обмен, в результате которого образуются рекомбинанты с генетическими признаками разных предков. Однако, в отличие от E. coli, Для образования рекомбинантов у сальмонелл не требуется контакта между родительскими клетками. Обмен генов происходил за счет фага P22, который содержался в одном из родительских штаммов в форме профага.

 

 Фаг P22 способен  трансдуцировать любой ген Salmonella. Такой вариант трансдукции получил наименование «общая», «неспецифическая». Было выяснено, что частота трансдукции для всех генов приблизительно одинакова и невысока — 10-5. Одновременно несколько признаков (генов), как правило, не передаются. Исключение составляют тесно сцепленные гены (расположенные рядом на хромосоме). Величина трансдуцируемого фрагмента ДНК ограничена объемом фаговой головки. Фаговая частица, осуществляющая общую трансдукцию и содержащая только бактериальную ДНК, не способна к вегетативному размножению и не «иммунизирует» клетку хозяина. Такие частицы возникают в результате ошибок при упаковке ДНК в фаговые капсиды.

 

 Фаги, подобные P22, были  выделены также и для E. coli, в  частности фаг P1. В экспериментах  по общей трансдукции генов E. coli фагом P1 была подтверждена правильность построения генетических карт хромосомы E. coli, уточнены расстояния между генами, созданы карты тонкой структуры генома.

 

 При трансдукции  фаги изменяют свойства бактериальной  клетки, привнося в нее генетическую информацию (фрагмент хромосомы) от предыдущей клетки-хозяина. Однако и сам «дикий» не дефектный профаг при лизогенизации клетки, делая ее «иммунной», может сообщать ей новые признаки. Такое явление получило название «фаговая конверсия». Например, E. coli после лизогенизации фагом λ приобретает устойчивость к ряду мутантов вирулентных T-четных фагов.

 

 Наличие профага  P1 в клетке E. coli делает ее устойчивой  к инфицированию неродственным  фагом λ. Фаг λ способен адсорбироваться  на лизогенизированных клетках E. coli и инъецировать в них свою ДНК. Затем эта ДНК подвергается рестрикции (разрезанию на несколько фрагментов) за счет эндонуклеазы, кодируемой профагом P1, после чего внутриклеточное развитие фага λ прекращается.

 

 Наиболее ярким  примером лизогенной конверсии служит образование дифтерийного токсина у Corynebacterium diphtheriae. После обработки нетоксигенных штаммов коринобактерий умеренными дифтерийными фагами среди выживших бактерий можно выделить токсигенные штаммы. При этом существует четкое соответствие между токсигенностью и лизогенностью. Однако, в отличие от системы E. coli — фаг λ, где конверсия проявляется в состоянии профага, образование дифтерийного токсина происходит только после индукции профага, в период внутриклеточного вегетативного развития фага. Таким образом, дифтерийный токсин является побочным продуктом вегетативного развития фага.

 

59)

Эписомы — генетические элементы бактерий, способные существовать как в интегрированном в бактериальные  хромосомы состоянии, так и в  виде автономных плазмид.

 

Эписомами являются факторы  фертильности бактерий (F-фактор и F'-фактор), участвующие в процессе конъюгации бактерий, факторы резистентности к  антибиотикам (R-плазмиды) и факторы  колициногенности.

 

Свойствами эписом обладают также геномы некоторых вирусов — умеренных бактериофагов (например, фаг лямбда), способные интегрироваться в геном бактерии-хозяина и существовать в виде профага, реплицирующегося вместе с бактериальной ДНК в качестве одного из «молчащих» бактериальных генов при делении клетки, и в автономном состоянии.

 

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные  в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или  линейные молекулы ДНК.

Передача по наследству

 

Плазмиды способны удваиваться (реплицироваться) автономно, но при этом они эксплуатируют репликационную систему клетки хозяина. Большинство плазмид кодирует специальные белки — инициаторы репликации. Эти белки начинают процесс репликации, который затем подхватывается и продолжается репликационной системой клетки.

 

Для кольцевых плазмид  известны несколько механизмов (способов) репликации:

механизм катящегося кольца (rolling cycle),

тетта-механизм (механизм «глазка»),

D-механизм.

Мобильные генетические элементы

 

 С момента возникновения  хромосомной теории наследственности до конца 70-х годов представление о том, что каждый ген имеет определенное место на хромосоме и не способен произвольно менять его, казалось незыблемым. Единственным известным способом перемещения генов друг относительно друга были хромосомные мутации — транслокации и инверсии. Другое очень распространенное и обоснованное представление гласит о том, что в геноме данного вида организмов содержится вполне определенное количество копий какого-либо конкретного гена. Изменение числа копий может также происходить в результате хромосомных мутаций — дупликаций и делений..В 40—50-х годах XX в. американская исследовательница Б. Мак-Клинток генетическими методами показала, что в хромосомах кукурузы предположительно существуют генетические элементы, способные перемещаться в геноме — исчезать с прежних мест и появляться в новых. Спустя четверть века американские и советские генетики независимо методами молекулярной биологии и генной инженерии доказали существование генетических элементов, способных к перемещению.

 

^ Свойства мобильных  генетических элементов. Мобильные  генетические элементы обнаружены  у самых разных организмов: у  бактерий, дрожжей, растений и  животных. Мобильные генетические  элементы, выделяемые у разных  видов, существенно отличаются по длине нуклеотидной последовательности и, следовательно, свойствам. У дрозофилы, хорошо изученной в этом отношении, описано около десяти типов мобильных элементов, одни из которых похожи друг на друга, иные резко отличаются. Количество копий, содержащихся в одном геноме, колеблется для разных мобильных элементов от К) до 1000. Длина нуклеотидной последовательности мобильных элементов варьирует в широких пределах, от 1 тыс. до 10 тыс. пар нуклеотидов. Наличие на концах длинных концевых повторов — типичная черта строения мобильных элементов.

 

^ Способы перемещения.  Существует, вероятно, не менее двух  способов перемещения мобильных  генетических элементов. Первый  из них связан с «вырезанием»  мобильного элемента в одном  месте хромосом и встройкой  его в другом месте. Такие перемещения, по-видимому, имеют обычно случайный, ненаправленный характер. Другой тип событий представляет собой направленные перемещения генетических элементов. В этом случае в исходном положении мобильный элемент сохраняется, но появляется и в новом, хотя и вполне определенном месте. Таким образом, в данном случае речь идет о появлении дополнительной копии мобильного элемента. Для этого необходимо удвоение молекулы ДНК данного мобильного элемента и его последующее встраивание в определенное место генома. Роль мобильных генетических элементов еще предстоит тщательно изучить. Однако в отдельных случаях уже имеется ясность. Так, Б. Мак-Клинток показала, что встраивание мобильного элемента рядом с геном, контролирующим окраску семян у кукурузы может включать этот ген. В результате окраска зерен изменяется, например с красной на белую. Прозорливость Б. Мак-Клинток состоит в том, что своими генетическими исследованиями она предсказала существование мобильных элементов в каком-либо гене или в непосред­ственной близости от него, что может приводить к резким наследуемым изменениям его состояния, т. е. по существу к появлению мутации.

 

 В последнее время  стало ясно, что многие давно  известные и хорошо изученные  точечные мутации у дрозофилы,  мыши и других организмов в действительности представляют собой результат встраивания или вырезания мобильных генетических элементов.

 

45% генома – подвижные  (мобильные, или мигрирующие) элементы (ПЭ).

 

^ Биологическая роль  ПЭ. Проявляются как в онто-, так  и в филогенезе.

 

 Горизонтальный перенос  устойчивости к антибиотикам, лекарствам, ядам – у бактерий.

 

 Мутации генов за  счет включения ПЭ в кодирующую часть генов.

 Вмешательство в  работу клеточных генов – изменение их активности (рак).

 Перестройки хромосом, перенос генов и целых наборов генов в пределах одного генома и из одного генома (напр., вируса) в другой (хозяина).

 Стабилилизация концов  хромосом у дрозофил.

 

Неканонические наследственные изменения

 отбором. Особенно  наглядным и убедительным оказался  метод реплик, изобретенный в начале 50-х годов супругами Ледерберг. С помощью бархатной материи они получали точные копии — отпечатки — опытного посева бактерий на чашке Петри. Затем на одной из чашек вели отбор на устойчивость к фагу и сопоставляли топографию точек появления устойчивых бактерий на чашке с фагом и в контроле. Расположение устойчивых к фагу колоний было одинаковым в двух чашках-репликах. Такой же результат получили и при анализе положительных мутаций у бактерий, дефектных по какому-либо метаболиту.

 

 

Открытия в области  подвижной генетики показали, что  клетка как целостная система  в ходе отбора может адаптивно  перестраивать свой геном. Она способна ответить на вызов среды активным генетическим поиском, а не пассивно ждать случайного возникновения  мутации, позволяющей выжить. А в опытах супругов Ледерберг у клеток не было выбора: либо смерть, либо адаптивная мутация.

 

В тех же случаях, когда  фактор отбора не летален, возможны постепенные  перестройки генома, прямо или  косвенно связанные с условиями  отбора. Это выяснилось с открытием в конце 70-х годов постепенного умножения числа локусов, в которых расположены гены устойчивости к селективному агенту, блокирующему деление клеток. Известно, что метотрексат — ингибитор клеточного деления — широко применяется в медицине для остановки роста злокачественных клеток. Этот клеточный яд инактивирует фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР), работу которого контролирует определенный ген.

 

Рассмотрим, как в ходе подобного отбора менялся геном  у одноклеточного паразитического жгутиконосца лейшмании Leishmania tropica, вызывающего кожные язвы и передающегося человеку москитами от грызунов. До начала опытов ген устойчивости был в геноме лейшмании в одной дозе. В результате отбора число генов устойчивости увеличилось (амплифицировалось). Что же наблюдали при разных вариантах отбора?

 

Устойчивость клеток лейшмании к яду-цитостатику (метотрексат) возрастала ступенчато, и пропорционально  увеличивалась доля амплифицированных  сегментов с геном устойчивости. Умножался не только селектируемый ген, но и большие прилежащие к нему участки ДНК, названные ампликонами. Когда устойчивость к яду у лейшмании повысилась в 1000 раз, амплифицированные внехромосомные сегменты составили до 10% ДНК в клетке! Можно сказать, что из одного облигатного гена образовался пул факультативных элементов. Произошла адаптивная перестройка генома в ходе отбора.