Шпаргалки по "Генетике"

исходной ДНК. Однако при клонировании рекомбинантных ДНК  с образованием отдельных вирусных бляшек в каждой вирусной частице из данной бляшки содержится уникальная рекомбинантная ДНК, состоящая из векторной ДНК и одного из сегментов исходного генома. Таким образом, технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять отдельные сегменты ДНК из чрезвычайно сложной смеси сегментов, происходящих из клеточного или вирусного генома.

В результате переноса какого-то гена Е. coli из бактериального генома в  геном трансдуцирующего фага можно  получить примерно 100-кратное обогащение по этому гену. По сравнению с  тем уровнем обогащения, которого удается достичь путем молекулярного клонирования сегментов ДНК сложных организмов, такое обогащение является незначительным. Например, ген млекопитающих длиной 5 т. п.н. составляет лишь одну миллионную часть всего генома и примерно одну десятую часть рекомбинантного генома фага X. Таким образом, молекулярное клонирование позволяет расщеплять даже самые большие и самые сложно организованные геномы и получать отдельные сегменты, содержащие один или несколько генов в чистом виде. Такое относительно простое применение принципов и методов, разработанных

Важные открытия

Как это часто бывает при развитии науки, методологии  рекомбинантных ДНК прокладывали путь многие открытия, казавшиеся ранее  незначительными и не имеющими отношения  к делу. Одним из таких открытий была трансдукция. Другие связаны с выделением и изучением свойств бактериальных плазмид и рестриктирующих эндонуклеаз.

Бактериальные плазмиды

Одним из неожиданных  следствий использования антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний  было появление устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов. Эта очень важная проблема требовала своего решения и стимулировала интенсивные исследования. Вскоре стало ясно, что устойчивость к лекарственным препаратам представляет собой относительно стабильный генетический признак, который может быть передан чувствительным бактериальным клеткам способом, напоминающим инфекционный процесс. Позже было установлено, что распространение резистентности к антибиотикам происходит при контактировании клеток друг с другом. Было показано, что резистентные к антибиотикам клетки содержат генетические элементы - плазмиды, не связанные с хромосомной ДНК, способные реплицироваться независимо от хромосомы и передаваться от клетки к клетке при их контактировании. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или R_факторов.

Механизм распространения R_факторов стал более понятен после  того, как был установлен способ переноса генетической информации от одной клетки к другой во время конъюгации бактерий. Перенос генетического материала осуществляется благодаря способности донорных клеток реплицировать и переносить свою геномную ДНК через конъюгационный мостик в клеки реципиента. Штаммы Е. coli, являющиеся донорами, содержат в составе своего генома ДНК плазмидного происхождения, названную фактором фертильности, или F_фактором. Такие донорные хромосомы образуются после приобретения клетками F_фактора и рекомбинации между этой плаз-мидой и хромосомой клетки. В присутствии интегрированного F_фактора облегчаются конъюгация и перенос хромосомы. Перенос инициируется в сайте интеграции F_фактора. Благодаря способности плазмиды встраиваться в ДНК во многих сайтах разные штаммы инициируют перенос в различных сайтах хромосомы E. coli. В некоторых случаях F_фактор остается в клетках в виде независимого внехромосомного элемента - F_плазмиды. Такие клетки, обозначаемые F+, переносят плазмиду F в реципиентные клетки таким же способом, как в случае переноса R_факторов.

R- и F_факторы представляют  собой ковалентно замкнутые кольцевые  молекулы двухцепочечной ДНК.  Оба они содержат гены, обеспечивающие  их репликацию в виде автономных  плазмид и их перенос при  контакте с соответствующими реципиентами. R_факторы несут также гены резистентности к антибиотикам. Одни такие гены изменяют реакцию клетки на антибиотик, другие индуцируют образование белков, вызывающих деградацию или модификацию определенных антибиотиков. Например, одна из R_плазмид кодирует в-лактамазу, обеспечивающую устойчивость к ампициллину благодаря деградации этого антибиотика. Устойчивость к хлорамфениколу обусловливается ацетилированием этого антибиотика. Ацетилирование катализируется ферментом хлорамфеникол-ацетилтранс-феразой, кодируемым плазмидой.

Плазмидные ДНК легко  выделить в больших количествах  и получить в очищенном виде, что  позволяет исследовать их потенциальную  способность служить векторами  для введения в клетки новых сегментов  ДНК. Соединение плазмидной ДНК с соответствующим образом модифицированными вставками можно осуществить in vitro аналогично тому, как это происходит в случае соединения вставок с фаговыми векторами. В этих экспериментах большую роль сыграл опыт осуществления трансформации клеток с помощью ДНК. Были разработаны методы включения очищенной плазмидной ДНК в клетки соответствующих бактерий-хозяев. Благодаря наличию в таких плазмидах генов резистентности к антибиотикам можно провести отбор клеток, содержащих R_плазмиду в качестве стабильно реплицирующейся структуры. Такие клетки живут и делятся в присутствии антибиотика, а клетки, утратившие эту плазмиду, погибают. Рекомбинантные плазмидные ДНК сохраняются в присутствии антибиотика как некие автономно реплицирующиеся геномы во время последующих клеточных делений. При клонировании образуются колонии клеток, содержащих уникальную рекомбинантную ДНК, потому что каждая клетка хозяина содержит только одну плазмиду. Поскольку размер многих плазмидных векторов не превышает нескольких тысяч пар нуклеотидов, обогащение по сегментам эукариотической ДНК в этом случае оказывается более высоким, чем при использовании фаговых векторов. Именно плазмиды оказались первыми векторами, с помощью которых было осуществлено молекулярное клонирование в клетках бактерий.

Рестриктирующие эндонуклеазы

Одним из наиболее важных результатов генетического изучения бактерий и их бактериофагов явилось  открытие рестриктирующих эндонуклеаз - ферментов, которые узнают специфические  короткие нуклеотидные последовательности и разрезают обе цепи двойной спирали ДНК в сайте узнавания или на некотором расстоянии от него. В открытии этих ферментов ключевую роль сыграло наблюдение, сделанное примерно 30 лет назад. Оно состояло в том, что бактериофаг, выращенный в клетках одного штамма, инфицируя клетки других штаммов этого же вида, часто растет очень плохо. Более того, выделенные после такой неэффективной инфекции бактериофаги в свою очередь плохо развиваются в исходных клетках. Этот феномен не связан с генотипом фага и был объяснен тем, что в фаге происходят какие-то модификации, контролируемые хозяином. Было высказано предположение, что некий фаговый компонент, необходимый для репликации, специфическим образом модифицируется в клетках хозяина, так что фаг может завершить репликацию при повторном инфицировании того же штамма. При этом его рост в неродственном штамме ограничивается, поскольку последний не содержит соответствующей системы модификации.

Было доказано, что  модифицируемым фаговым компонентом  является ДНК, а неспособность фага реплицироваться в неродственном штамме обусловлена деградацией инфицирующей фаговой ДНК. Расщепление ДНК инициируется внесением нескольких разрывов в высокоспецифичных сайтах, после чего происходит полная неспецифическая деградация. Модификацией, защищающей некоторые инфицирующие фаговые ДНК, а также геном клетки от разрывов, является штамм-специфичное метилирование ДНК. С помощью генетических и биохимических исследований установлено, что метилирование ДНК происходит в строго специфических участках. Рестрикция осуществляется эндонуклеазами, которые узнают аналогичные короткие специфические последовательности, лишенные метильных групп. Системы модификации и рестрикции всегда соответствуют друг другу, т.е. метилирование и разрезание происходят в одних и тех же последовательностях ДНК. В каждой системе в качестве мишеней для штамм-специфичных систем рестрикции-модификации используются свои короткие последовательности ДНК. Метилированная ДНК не разрезается по этой последовательности родственной рестриктирующей эндонук-леазой. Аналогично рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только те ДНК, у которых не модифицированы соответствующие сайты рестрикции. Регуляция системы рестрикции и модификации осуществляется с помощью родственных наборов генов, и такие парные системы имеются у многих видов бактерий, бактериофагов и плазмид.

При анализе генетической и физической организации сложных  геномов особенно важными оказываются  два свойства рестриктирующих эндонук-леаз. Первое связано с огромным диапазоном специ-фичностей, проявляемых в совокупности различными рестриктирующими эндонуклеазами, что позволяет разрезать практически любую ДНК на дискретные фрагменты самыми разными способами. Эти фрагменты можно разделить по размерам с помощью гель-электрофореза. Распределение фрагменов по размерам, получающееся при расщеплении данной эндонуклеазной ДНК в специфических сайтах, является своего рода «отпечатком пальцев», характерным для этой ДНК. Второе свойство эндонуклеаз рестрикции связано со способностью многих из них осуществлять несимметричные разрезы двухцепочечной ДНК, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Это позволяет проводить рекомбинацию ДНК in vitro. Любые два сегмента ДНК со взаимодополняющими концами могут объединиться, в результате чего происходит встраивание фрагментов в фаговую, плазмидную ДНК или другие потенциальные векторы. Такие специфические комбинации «вектор-вставка» можно получить в чистом виде путем молекулярного клонирования и амплификации в соответствующих хозяйских клетках.

Развитие методологии  рекомбинатных ДНК и молекулярного  клонирования само по себе привело  к созданию новых областей биологических  исследований. Однако полная реализация этих новых возможностей зависела от других проводимых одновременно разработок: развития методов фракционирования, которые позволяли бы разделять фрагменты ДНК, лишь незначительно различающиеся по длине; создания относительно простых и быстрых процедур секвенирования ДНК длиной несколько тысяч нуклеотидов; получения специфически модифицированных генов путем внесения мутаций в их клонированные копии in vitro; генетической трансформации клеток, тканей и всего организма путем введения клонированных генов в соответствующие системы.

Часто обращается внимание на ранние результаты, благодаря которым был разработан тот или иной метод. Ученые, получившие эти результаты, не могли предвидеть, как они скажутся на развитии технологии рекомбинантных ДНК. Теперь мы знаем, что именно успехи в молекулярной генетике прокариот и в изучении ферментов, осуществляющих синтез и деградацию нуклеиновых кислот, открыли путь к исследованию эукариотических геномов.

59)

Эписомы – генетические элементы бактерий, способные существовать как в интегрированном в бактериальные  хромосомы состоянии, так и в  виде автономных плазмид.

                - это генетический элемент, который  может существовать либо в  форме репликона отдельно от  бактериальной хромосомы, либо  встраиваться в бактериальную  хромосому и составлять при  этом часть репликона бактерии.

Эписомами являются факторы фертильности бактерий (F-фактор и F'-фактор), участвующие в процессе конъюгации бактерий, факторы резистентности к антибиотикам (R-плазмиды) и факторы колициногенности.

 Эписомой является  и бактериофаг X, способный существовать  как вне клетки в форме фага, так и внутри бактериальных клеток, либо в качестве отдельного репликона (при литической инфекции), либо в форме профага, составляя часть бактериального репликона. В противоположность эписомам, плазмиды не встраиваются в другие репликоны, а всегда существуют в форме свободных (автономных) репликонов. Однако, большинство плазмид не покидают пределов клетки и не образуют внеклеточных форм. Некоторые эписомы инфекционны, поскольку их копии могут переходить из одной бактериальной клетки в другую, в которой исходно эписом данного типа не было. Генетические функции, необходимые для репликации, инфекционности и способности вытеснять другие эписомы, кодируются эписомальной ДНК. Во многих эписомах содержатся также гены, не необходимые для их существования. Например, некоторые инфекционные эписомы содержат гены устойчивости к определенным ан­тибиотикам. Бактерии, в которые попадает такой фактор устойчивости, становятся устойчивыми к данному антибиотику. Имея высокую селективную ценность в современных условиях насыщения антибиотиками, факторы устойчивости быстро распространяются среди различных штаммов и видов бактерий, в том числе патогенных. Это создает серьезные проблемы для медицины. Особенно опасна способность факторов устойчивости накапливать гены, обусловливающие устойчивость к разным антибиотикам, и передавать ранее чувствительным бактериям множественную устойчивость.

Одна из наиболее интересных и тщательно изученных эписом получила наименование F-фактора (фактора  фертильности). F-фактор определяет половой процесс у Е. coliF-фактор: генетический элемент, определяющий пол бактерий. F-фактор обладает поразительной способностью определять пол, казалось бы, бесполых бактерий. Его существование было обнаружено генетиками, когда они пытались определить, происходят ли скрещивания

Плазмиды – дополнительные факторы наследственности, расположенные  в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или  линейные молекулы ДНК.

                   - внехромосомный самовоспроизводящийся  генетический элемент (фактор наследственности) бактерий и некоторых др. организмов. Представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, закрученную в суперспираль. Размеры плазмида необычайно широко варьируют от 2 тыс. до неских сотен тысяч пар оснований; некоторые из них содержат 1 – 3 гена, другие достигают 10 – 20% размера бактериальной хромосомы.