Шпаргалки по "Генетике"

 

Большинство плазмид  может передаваться от одной бактерии к другой при конъюгации клеток (трансмиссибельные  плазмида). Такие плазмиды способны провоцировать конъюгацию между бактериями и тем самым обеспечивают собственную миграцию от клетки к клетке и распространение среди бактерий. Нетрансмиссибельные плазмида передаются благодаря конъюгативным плазмидам-помощникам. Во мн. случаях для переноса плазмида между клетками необязательна конъюгация последних. Так, мелкие плазмидымогут передаваться в виде коинтегратов с бактериофагами (вирусами микробов).

 

Число копий плазмида в клетке зависит от их генетических особенностей плазмида, находящиеся  под «ослабленным контролем», могут реплицироваться до тех пор, пока каждая клетка не будет содержать в среднем от 10 до 200 копий. Плазмиды, находящиеся под «строгим контролем», реплицируются примерно с той же скоростью, что и хромосома, и содержатся в клетке в виде одной или нескольких копий. В обоих случаях благодаря контролируемой репликации число плазмид в клетке поддерживается постоянным в ряду поколений.

 

У бактерий наиболее изучены  три главные группы плазмид: F-плазмида (факторы фертильности) ответственны за половой процесс, R-плазмида (факторы резистентности) обеспечивают устойчивость бактериальных клеток к действию антибиотиков и сульфаниламидным препаратам, в Col-плазмида (колициногенных факторах) локализованы гены синтеза колицинов (бактериоцинов) – токсичных белков, которые не действуют на производящую их клетку, но убивают др. бактерии.

 

Плазмиды широко используются в генной инженерии для переноса генетической информации и генетических манипуляций. Для этого создаются  искусственные плазмиды – вектора, состоящие из частей, взятых из разных генетических источников, а также из искусственно созданных фрагментов ДНК.

 

Одной из интереснейших  тем современной молекулярной биологии, генетики и эволюции стало изучение плазмид почвенных бактерий –  агробактериума. Эти плазмиды попадают в клетки растения от бактерии при повреждении растительных тканей. Попав в клетку, бактериальная плазмида встраивается в хромосому растения и «заставляет» растение синтезировать и выделять в почву аминокислоты, которые усваиваются только клетками агробактериума. Это единственный пока пример обмена генетическим материалом между прокариотами и эукариотами.

 

Ученые разработали  методы выделения и введения плазмид  в бактериальные клетки. Можно, используя  специальные ферменты, разрезать  плазмиды, встраивать в них новые гены и сшивать молекулы. Такие плазмиды служат для переноса генетической информации (т. е. являются векторами) в генной инженерии.

 

 

61)

Успехи генетической инженерии стали возможны благодаря  изучению ферментов, позволяющих проводить  химические операции с генетическим материалом. В генетической инженерии используется большая группа ферментов, способных гидролизовать, «разрезать» молекулы ДНК и РНК по специфическим центрам, «сшивать» фрагменты нуклеиновых кислот с образованием фосфодиэфирных связей, проводить полимеризацию нуклеотидов на матрице одноцепочечной ДНК или РНК. Совокупность этих свойств ферментов позволяет манипулировать ДНК, проводить ее модификацию.

Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)

 

Это гидролазы, способные  специфически сорбироваться на определенных последовательностях двухцепочечных молекул ДНК и гидролизовать определенные связи. Ферменты «узнают» короткие нуклеотидные последовательности ДНК и гидролизуют фосфодиэфирные связи в области этих последовательностей.

 

В настоящее время известно около 400 ферментов типа рестриктаз, способных расщеплять молекулу ДНК примерно в 90 различных центрах узнавания.

 

Ферменты выделяют из различных бактерий, что отражено в их названиях.

 

Классическим примером рестриктаз является эндонуклеаза ЈcoRI. Этот фермент гидролизует ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'—GAATTC—3'. Эта последовательность является палиндромной, т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в разных направлениях.

 

 

Разрезание молекулы ДНК происходит вдва этапа. Вначале  гидролизуется одна цепь, потом —  другая. Как видно, продуктами реакции  являются два двухцепочечных фрагмента  с комплементарными одноцепочечными  концами 5'—ААТТ—3'. Одноцепочечные концы такого типа называют «липкими». Фрагменты, полученные в результате действия ZfcoRI из двух разных ДНК, могут соединиться водородными связями и в дальнейшем могут образовать химическую связь под действием лигазы. Эндонуклеаза EcoRl представляет димер, который имеет молекулярную массу 31000. Белок образует комплекс с центром ДНК протяженностью около десяти пар, внутри этой последовательности находится специфический центр узнавания. Каталитический центр фермента образован комплексом ионов Mg + с карбоксильными группами аспарагиновой кислоты.Центр сорбции в активном центре фермента формируется аргинином и глутаминовой кислотой, образующими водородныесвязи с основаниями вспецифическом центре рестрикции.

 

Большой набор рестриктаз обеспечивает возможность выборапри формировании различных «липких» концов.

 

В генетической инженерии  также применяются рестриктазы, разрезающие фосфодиэфирную связь  в середине «узнаваемой» последовательности. В результате возникают фрагменты  ДНК с «тупыми» двухцепочечными  концами.

 

Применение эндонуклеаз различной специфичности обеспечивает возможность разрезания молекулы ДНК на фрагменты различной длины. Полученные фрагменты могут быть разделены методом электрофореза, выделены и на следующем этапе включены в различные рекомбинантные ДНК-конструкции. Сшивку различных фрагментов ДНК осуществляют ферменты, получившие название лигаз.

 

ДНК-лигазы. Объединение  различных фрагментов ДНК invitroосуществляют с помощью лигаз. В случае если фрагменты ДНК имеют «липкие» концы, два одноцепочечных участка  могут образовывать комплекс за счет комплементарных взаимодействий с  помощью водородных связей. Комплекс может быть трансформирован в прочную химическую связь под действием ДНК-лигазы. Фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между соединенными нуклеотидами. Поскольку процесс является обратным гидролизу и в водной среде термодинамически невыгоден, реакция идет с расходом АТФ (иногда НАД+). Каталитически важной группой является Е—NH2- группа лизина. На первой стадии процесса происходит аденилирование активного центра.

 

Существуют лигазы, способные  провести сшивку двух фрагментов ДНК с «тупыми» концами. Наиболее известна в этом плане ДНК-лигаза фага Т4, соединяющая «тупые» концы двуцепочечной ДНК.

 

ДНК-полимеразы. Эти ферменты осуществляют синтез второй молекулы ДНК на матрице первой. Необходимым  условием реакции является наличие  праймера, комплементарного концу полимерной цепи. Фермент достраивает вторую цепь, имея дуплекс в качестве «затравки» реакции.