Шпаргалки по "Генетике"

Спустя некоторое время  ему удалось выделить из зараженных мышей живые пневмококки, обладающие капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка – способность образовывать капсулы – перешло к живой бактерии, то есть, произошла трансформация этих клеток. От этого превращения клеток  и возник сам этот термин. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма – S перешла к клеткам штамма – R. В 1944 году О. Эвери, К. Мак – Леод и М. Мак-Карти показали, что такое же превращение типов пневмококков может происходить в пробирке in vitro. Эти исследователи установили существование особой субстанции – «трансформирующего принципа» – экстракта из клеток штамма – S, обогащенного ДНК. Как далее выяснилось, ДНК, выделенная из клеток S-штамма и добавления в культуру R-штамма , трансформировала часть клеток в S-форму. Клетки стойко передавали это свойство при дальнейшем размножении. Обработка трансформирующего фактора ДНК-азой – ферментом, разрушающим ДНК, блокировала трансформацию. Открытие этого явления было первым прямым доказательством того, что генетическим материалом является именно ДНК (а не белки, как предполагалось ранее).Известны два типа бактериальной трансформации: естественная, например у Bacillus subtilis, и индуцированная, которая связана с тем, что бактериальная клетка специально готовится к процессу переноса ДНК, то есть она приобретает компетентность к трансформации.Весь процесс можно разделить на несколько стадий: ☺     Контакт с поверхностью клетки☺     Проникновение ДНК в клетку☺     Соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом хромосомы реципиента☺     Репликация включенной в хромосому новой информации.Трансформацию наблюдали у многих бактерий, в частности у представителей родов Bacillus, Rhizobium, Streptococcus.Компетентные клетки несут на поверхности новый антиген. Называемый фактором компетентности. При добавлении факторов компетентности в культуру бактериальных клеток изменяются клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана. Стенка становится более пористой. Дополнительные впячивания мембраны внутрь клеток обеспечивают приближение присоединенного к ней нуклеоида к клеточной поверхности, что облегчает взаимодействие между донорной и реципиентной ДНК. Условиями, существенными для присоединения ДНК к компетентным клеткам, являются ее размеры (молекулярная масса не менее 3*10^5 и интактность двуцепочечной структуры). По этим причинам ДНК, разрушенная ДНК-азой, не обладает трансормирующей активностью. Увеличить компетентность можно обработкой некоторыми химическими агентами или воздействием сильным электрическим полем (электропорация).             В ходе трансформации одна из двух цепей ДНК деградирует и в клетку проникает другая, которая спаривается с гомологичным цчастком ДНК в реципиентной клетке, с цепью, являющейся комплементарной ей. Затем в результатае двойного кроссинговера между однонитчатой донорной ДНК и двунитчатой ДНКреципиента происходит образование рекомбинантной хромосомы реципиента. При этом у участке ДНК, ограниченном сайтами кроссинговера, одна нить ДНК имеет реципиентный сегмент, а вторая – донорный. Такие районы ДНК с различающимися последовательностями нуклеотидов в двух нитях называют гетеродуплексами. Уже после первого раунда репликации ДНК образуются два типа клеток: исходные и трансформированные, которые несут ДНК донора. Первые стадии трансформации – присоединение ДНК к клеточной оболочке, ее поглощение и деградация одной цепи – осуществляются с равной  эффективностью независимо от ее гомологии с ДНК реципиента.Однако, процесс рекомбинации специфичен в отношении гомологичной ДНК и с негомологичной происходит с очень низкой частотой. Минимальная длина цепочки  ДНК, способной интегрироваться в реципиентную хромосому, составляет около 500 пар нуклеотидов.  Обычно в рекомбинации участвуют фрагменты донорной ДНК длиной около 200 тысяч пар нуклеотидов, или около 1 /200 всей бактериальной хромосомы.Частота трансформации по хромосомным маркерам зависит от свойств данного препарата ДНК, ее концентрации, состояния клетки реципиента, вида бактерий. У пневмококков при селекции по одиночному маркеру частота трансформации составляет 10^ -2 – 10^ -3 на одну клетку реципиента. У гемофильных бактерий частота трансформации варьирует от 10^ -3 до 10^ -7. Трансформация, хотя и с очень низкой частотой, может происходить даже между разными видами бактерий, что помогает установить степень родства между ними.             ДНК, освобождающееся в окружающуюся среду при лизисе стареющих культур бактерий, в природных условиях обладает трансформирующей способностью. Это значит, что трансформация является одним из природных способов обмена генетическим материалом у бактерий.Очень редко бывает, что единичная бактериальная клетка приобретает в результате трансформации более чем одно новое свойство. Передача через ДНК большего числа признаков наблюдается лишь в том случае, если культура микроба-донора генетически близка к клеткам микроба-реципиетна.С помощью трансформирующей ДНК могут передаваться такие признаки, как капсулообразование, синтез необходимых клетке веществ, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и другим лекарственным веществам.             Трансформация используется также для генетического картирования у бактерий. Как уже отмечалось, при трансформации в хромосому реципиента встраивается сравнительно небольшой фрагмент ДНК. Если два гена находятся в хромосоме на значительном расстоянии друг от друга, они не могут локализоваться в одном и том же фрагменте, трансформирующий ДНК. Одновременная котрансформация двумя независимыми фрагментами, содержавшими эти гены, - событие крайне мало вероятное. Таким образом, частота котрансформации двух генетических маркеров служи показателем расстояния между ними.

 

57)

В связи с тем, что  средой для развития бактериофага являются живые клетки молочнокислых бактерий, особое значение имеет взаимоотношение между бактериофагом и микроорганизмами закваски. Бактериофаг может длительное время находиться в клетках бактерий, не принося им заметного вреда (так называемое явление лизогении). При изменении условий внешней среды бактериофаг может начать развиваться и вызвать растворение (лизис) и гибель клетки. В свою очередь некоторые культуры оказываются устойчивыми к бактериофагу и не подвергаются лизису в его присутствии.

 

 

Стимулирующее действие на внедрение бактериофага н клетку бактерий и его развитие оказывает наличие в среде ионон кальция, перемешивание среды.

 

Бактериофаг, поражающий молочнокислые бактерии, не погибает при нагревании до температуры 75 °С с выдержкой до 15 мин. Следовательно, принятые в промышленности режимы термической  обработки не исключают возможности сохранения его в молоке. Бактериофаг длительно сохраняется в высушенном состоянии и на холоду. Однако он чувствителен к свету, особенно к его ультрафиолетовым лучам и к растворам, содержащим хлор (200 мг активного хлора на 1 л).

 

Наиболее характерные  признаки развития бактериофага в заквашенном  молоке—нормальное размножение  микроорганизмов закваски в первые 3—5 ч после заквашивания и последующее  полное или частичное исчезновение клеток. При этом кислотность в  первые часы нарастает до 28—30 °Т, а в дальнейшем повышение ее прекращается. При умеренном и слабом развитии бактериофага молоко сквашивается, но медленнее, чем обычно. При микроскопировании окрашенных препаратов обнаруживается явление склеивания клеток, наличие неестественно утолщенных и вытянутых клеток. При производстве продуктов, например творога, полного несквашивания обычно не наблюдается, так как молочнокислый процесс продолжается в результате развития посторонней молочнокислой микрофлоры, содержащейся в пастеризованном молоке. Однако при таком развитии нерегулируемой микрофлоры возникают пороки готового продукта — посторонний вкус, излишняя кислотность.

 

На предприятия молочной промышленности бактериофаг попадает обычно с сырым молоком, сывороткой или с заквасками, содержащими  бактериофаг внутри клеток. Бактериофаг, только что попавший в молоко, как  правило, может лизировать лишь ограниченное количество культур. Установлено, что если в состав закваски входит несколько разных культур молочнокислых стрептококков, то даже в том случае, когда в закваске развивается бактериофаг, он поражает одну культуру, а остальные продолжают развиваться и сквашивание протекает нормально. Поэтому обычно в закваски вводят несколько культур молочнокислых стрептококков. Однако в том случае, если закваска с одним и тем же составом культур применяется на производстве длительное время, в ней постепенно накапливается бактериофаг, который может поражать не однудве, а все или почти все культуры, входящие в состав закваски. В результате этого происходит полное несквашивание молока при производстве закваски. Поэтому при составлении заквасок практикуют более или менее частую смену культур. В этом случае бактериофаг, который сначала развивается на одной какой-то культуре, самопроизвольно отмирает.

 

Второй способ предупреждения развития бактериофага на производстве состоит в подборе для заквасок культур, устойчивых по отношению к  бактериофагу и не содержащих бактериофаг внутри клеток (не лизогенных). Этот способ в сочетании с постоянной сменой культур обычно позволяет полностью предотвратить развитие бактериофага на производстве.

Трансфе́кция  — процесс введения нуклеиновой  кислоты в клетки человека и животных невирусным методом [1]. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация.

 

Трансфекция обычно включает образование в плазматической мембране отверстий через которые внутрь клетки может проникать внеклеточный материал. Трансфицирован может быть генетический материал, такой как ДНК или РНК, а также белки, например, антитела. Для трансфекции часто используют сильное электрическое поле (электропорация) или электростатически заряженные липиды, способные к образованию липосом, структур, которые сливаются с плазматической мембраной, выбрасывая внутрь клетки заключенный в них материал. Известны и другие методы трансфекции.

 

Первоначальный смысл  слова трансфекция: инфекция для  трансформации, т.е. введение в клетки вирусного генома, в результате чего начинается инфекция. Но, поскольку в приложении к человеку и животным термин трансформация имеет иное значение (генетические изменения, позволяющие вести клетки в культуре в течение длительного времени, преодолевая лимит Хейфлика, что типично, например, для раковых клеток), термин трансфекция было предложено использовать как замену термину трансформация в смысле изменения фенотипа путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты.

Типы взаимодействия фагов с бактериями

 

 На основании особенностей жизненного цикла бактериофаги разделяют на две группы:

 

1) вирулентные бактериофаги  — фаги, жизненный цикл которых  завершается лизисом клетки хозяина  и выходом зрелых фаговых частиц;

 

2) умеренные или лизогенизирующие  бактериофаги — фаги, способные после проникновения в бактериальную клетку переходить в состояние профага и длительное время реплицироваться совместно с бактериальным геномом, передаваясь очередному поколению бактерий.

 

 Существуют два  основных типа взаимодействия  фагов с бактериями — продуктивный и лизогенный, осуществляемый, соответственно, вирулентными и умеренными фагами.

 

 

Продуктивный тип взаимодействия

 

 После проникновения  нуклеиновой кислоты фага в  клетку начинается экспрессия  фаговых генов, при этом используется синтетический аппарат клетки-хозяина. В первую очередь синтезируются белки, регулирующие работу фагового генома, ферменты, участвующие в синтезе фаговых нуклеиновых кислот. Затем реплицируется геномная нуклеиновая кислота фага и синтезируются структурные белки фагового капсида. Механизм репликации фагового генома зависит от его вида и в общих чертах подчиняется принципам, изложенным в разделе «Репликация вирусных геномов». На последнем этапе происходит сборка фаговых зрелых частиц.

 

 Продуктивный тип  взаимодействия сопровождается наработкой зрелого вирусного потомства и может завершаться двумя исходами — лизисом клетки и внезапным выходом в среду вновь образовавшихся вирионов (литический тип взаимодействия) или секрецией вирионов в среду, не сопровождающейся разрушением клетки хозяина (секреторный тип взаимодействия).

 

 При литическом  типе взаимодействия к моменту  завершения сборки фаговых частиц  нарабатываются особые, так называемые, киллерные белки, которые убивают  бактериальную клетку, останавливая  все метаболические процессы и разрушая клеточную стенку. Зрелые фаговые частицы выходят во внешнюю среду не в результате механического разрушения бактериальной клетки, а в результате лизиса изнутри. Каждая из этих частиц способна инфицировать чувствительную бактериальную клетку и повторить вышеописанный цикл развития.

 

 Уникальное завершение  жизненного цикла наблюдается  у иновирусов (фаги E. coli f1, M13). Зрелые  нитевидные частицы этих фагов  секретируются из зараженной  клетки без лизиса последней.  Иновирусы инфицируют только мужские клетки, так как адсорбируются на кончиках F-пилей. В процессе морфогенеза фаговые белки концентрируются на внутренней поверхности клеточной мембраны, зрелые молекулы ДНК проходят через мембрану, захватывая капсидный белок, и секретируются в среду. Иновирусы выделены из E. coli (фаги f1, fd, M13), Salmonella (фаги if1, if2), Pseudomonas (фаги Pf1, Pf3), Xanthomonas (бактериофаг Xf), Vibrio (бактериофаг v6).

 

 Особый интерес  представляет фаг M13. Существование  этого вируса в двух формах — репликативной (в форме плазмиды) и секреторной (инкапсидированная однонитевая кольцевая ДНК) делают его удобным инструментом молекулярно-генетических исследований. Путем различных модификаций генома фага М13 сконструирован целый ряд удобных векторов клонирования на основе репликативной формы. Секретируемая одноцепочечная рекомбинантная молекула ДНК широко применяется при определении нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК.

 

 

Лизогенный тип взаимодействия

 

 У умеренных бактериофагов  первые две стадии жизненного цикла совпадают со стадиями жизненного цикла вирулентных фагов. После введения нуклеиновой кислоты в клетку хозяина умеренные фаги способны в дальнейшем либо пойти по литическому пути, аналогично вирулентному фагу, либо перейти в особое состояние, получившее название «профаг». При этом генетический материал фага интегрирует в бактериальную хромосому или переходит в плазмидоподобное состояние и реплицируется синхронно с геномом клетки. Все бактерии — потомки клетки, инфицированной умеренным фагом, содержат профаг. Такая бактериальная культура называется лизогенной. Лизогенная культура может существовать продолжительное время.

 

 Лизогенная культура  обладает следующими свойствами: она устойчива к повторной  инфекции данным типом фага или фагами, близкородственными ему; всегда содержит небольшое количество зрелых фаговых частиц, о чем свидетельствует спонтанный лизис отдельных клеток в культуре.

 

 Для системы «лизогенная  бактерия — профаг» описано  явление, получившее наименование  индукция. При индукции профаг активизируется во всех клетках лизогенной культуры, в результате чего наблюдается продуктивный цикл развития фага, завершающийся полным лизисом клеток и выходом зрелого фагового потомства. Индукция может происходить как спонтанно, без видимых причин, так и в результате воздействия определенных факторов, получивших название индукторов. К индукторам относятся ультрафиолетовое излучение, мутагены, такие как нитрозогуанидин, акридиновые красители и ряд других.

 

В результате детального изучения различных типов мутантов фага λ было показано, что в формировании и поддержании лизогенного состояния участвует белок cI, получивший название иммунитетный репрессор. Установлено, что белок cI связывается с фаговой ДНК в районе области иммунности. В этой области на хромосомной карте фага λ, между геном N и геном CII находятся два промотора PR (R — правый) и PL (L — левый) с соответствующими им операторами OR и OL(, (схема 9). Именно с этими операторами и связывается белок cI, выполняя регуляторную функцию белка-репрессора.

 

 Блокирование белком cI левого оператора предотвращает  синтез мРНК с гена N, а блокирование  правого оператора предотвращает  синтез мРНК с генов O и P. Продукты генов N, O, P необходимы  для выражения всех остальных  генов фага λ, поэтому прямое действие репрессора на операторы OR и OL косвенным образом подавляет выражение практически всего генома.

 

 

Схема 9

 

 

Каждый оператор состоит  из трех участков длиной 16 нуклеотидов, расположенных тандемно, и способен связывать от 1 до 3 молекул белка cI. Присоединение хотя бы одной молекулы репрессора предотвращает достижение РНК-полимеразой точки инициации транскрипции.

 

 Существует репрессор  синтеза репрессора cI, являющийся  продуктом гена его. В клетке, содержащей геном фага λ, образование  репрессора cI и репрессора репрессора cro являются взаимно исключающими состояниями. При лизогенизации и поддержании лизогении синтезируется репрессор cI и подавлен репрессор репрессора cro. При литической реакции репрессор репрессора образуется, а образование репрессора cI подавлено.

 

 В клетке, инфицированной  умеренным фагом λ, могут протекать  как события, приводящие к лизогенизации,  так и события, приводящие к  продуктивному развитию фага. Выбор  определяется соотношением уровня  синтеза репрессора cI и уровня синтеза продукта гена его. Так, суперинфицирование нормальным фагом лизогенных клеток, содержащих продукт его, всегда приводит к литической реакции, а суперинфицирование нормальным фагом лизогенной клетки, содержащей репрессор cI, никогда не приводит к литическому ответу.