Получение и применение моноклональных антител

10.  Наработка гибридомных клеток и секретируемых ими антител. 

     Наиболее  широко используются сейчас два способа  наработки гибридомных клеток и моноклональных антител: наработка на культуральных средах в СО2 инкубаторе и в асцитных жидкостях мышей (или крыс). Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки. 

10.1. Наработка  на культуральных средах в СО2 инкубаторе.

     После того, как отобраны стабильно продуцирующие  клоны, переходят к наработке  антител, чтобы получить достаточное  их количество для более подробного изучения их свойств.Гибридомные клетки очень чувствительны к перемене условий их содержания, поэтому необходима плавность и постепенность при увеличении объема ростовой среды и культуральной посуды: из одной лунки 96-луночного планшета клетки рассевают на несколько лунок такого же планшета, затем, когда плотность клеток в них будет достаточно большой, клетки из нескольких лунок переносят в одну лунку большего размера и т.д. Когда количество клеток будет достаточным для производства требуемых количеств антител, содержание эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в ростовой среде постепенно или резко снижают (до концентрации <1%). Рост и деление клеток при этом сильно замедляется, клетки переключаются на секрецию антител. Супернатанты клеток стерильно отбирают, проверяют на содержание специфичных антител и собирают для дальнейшей очистки.

     Для наработки антител в промышленных масштабах используют различные  приспособления (цитокультиваторы, ферментеры и т.д.), в которых соблюдаются необходимые условия культивации клеток (температура, уровень СО2 и влажности), а также частично или полностью автоматизированы подача питательных сред и отбор супернатантов. 

10.2. Наработка  антител в асцитных жидкостях.

     Наименее  хлопотный способ наработать большое  количество антител- это ввести гибридомные клетки в перитонеальную полость мыши (или крысы). Через 6-30 дней (чаще через 10-14) в зависимости от числа введенных клеток и скорости их деления в перитонеальной полости образуется асцитная жидкость, содержащая большое количество гибридомных клеток и монАТ (концентрация антител в асцитах может достигать 20мг/мл). Для лучшей приживаемости гибридомных клеток и во избежание развития солидных (твердых) опухолей мышам предварительно (за 7-20 дней до введения клеток) вводят минеральное масло- пристан. Если все-таки вместо асцитной жидкости образовалась солидная опухоль, ее извлекают, гомогенизируют, и в фосфатно- солевом буфере вводят другим мышам.

     В процессе развития асцитной опухоли клетки гибридомы оздоравливаются, избавляются от бактериальной и вирусной инфекций. Скорость роста извлеченных из асцита клеток, как правило, значительно выше, чем до введения их в перитонеальную полость мышей.

     Количество  клеток, вводимых мышам, может быть любым: от нескольких десятков или сотен  клеток до нескольких сотен миллионов. Однако следует учитывать, что при  очень маленьком количестве вводимых клеток увеличивается время образования  асцита, при очень большом- есть риск гибели мыши, если клетки заражены микоплазмой. В целом успех выращивания асцитной жидкости зависит, в основном, от качества мышей (их линейности - генетического соответствия требуемой линии).

     Наработке антител в асцитных жидкостях во многих странах препятствует законодательство, считая эту процедуру негуманной по отношению к животным. В нашей стране пока такого запрета нет, но соответствующий законопроект уже обсуждается.

     Наработка антител с использованием генноинженерных методов применяется только для наиболее ценных гибридом и будет подробно обсуждаться в следующей главе. 

11. Хранение клеток. 

     Клетки  годами можно хранить в жидком азоте без существенной потери их жизнеспособности. Заморозку клеток производят, когда они находятся  в логарифмической фазе роста. Суспензию  клеток, предназначенных для заморозки, помещают в раствор, содержащий 10-90% сыворотки, 5-10% ДМСО и в остальном- ростовую среду. Присутствие сыворотки смягчает процессы замораживания- оттаивания клеток, ДМСО препятствует при заморозке образованию крупных кристаллов воды, губительных для клеточной стенки.

     Понижение температуры при заморозке производят постепенно, существуют даже специальные  приборы, позволяющие снижать температуру  с заданной скоростью. В основном же бывает достаточно предварительно поместить ампулу с клетками в  морозильник на -70ºС, а затем перенести в специальный сосуд с жидким азотом (сосуд Дьюара). Неудобство хранения клеток жидком азоте состоит в необходимости регулярно доливать азот в эти сосуды. Для менее продолжительного хранения клеток можно использовать морозильники с температурой от -70ºС и ниже.

Наиболее  ценные гибридомы можно хранить в виде векторов (плазмид или нитчатых фагов), куда вставлены гены, кодирующие иммуноглобулины этих гибридом. Этот метод хранения более надежен, но требует предварительной работы по изготовлению таких векторов. 

12. Выделение монАТ из супернатантов гибридом и асцитных жидкостей. 

     При выборе методов выделения нужно  учитывать следующее:

а) желаемая степень очистки в соответствии с дальнейшим использованием выделенных антител;

б) источник антител (супернатанты клеток или асцитная жидкость)

в)  класс и субкласс выделяемых антител;

г) индивидуальные особенности конкретных монАТ.

     Основным  белком, подлежащим удалению при очистке, является альбумин (бычий в супернатантах и мышиный в асцитах). Его количество в десятки раз превосходит количество выделяемых антител. 

12.1. Методы  предварительной очистки антител:  высаливание сульфатом аммония (натрия), преципитация каприловой кислотой, диализ против дистиллированной воды при выделенииIgM.

     Метод высаливания сульфатом аммония состоит в следующем: при смешивании образца антител с эквивалентным объемом насыщенного сульфата аммония происходит выпадение осадка, содержащего, главным образом, иммуноглобулины. Осадок растворяют в фосфатном буфере и диализуют. Процедуру повторяют при необходимости несколько раз. Степень очистки антител можно повысить, снижая концентрацию сульфата аммония, но при этом придется столкнуться с потерями антител. При повышении концентрации соли (до 60% от насыщения) выход антител увеличивается, но увеличивается и содержание загрязняющих компонентов, главным образом, альбумина. Недостатком метода является недостаточная степень очистки антител, поэтому часто его применяют в качестве предварительного метода, позволяющего увеличить концентрацию антител в образце.

     Для очистки каприловой кислотой образец антител должен иметь рН 4, поэтому эго предварительно разбавляют 60 мМ ацетатом натрия. Каприловую кислоту добавляют по каплям при помешивании, получающийся при этом осадок содержит загрязняющие белки, IgG остается в растворе. После диализа раствор антител концентрируют и проверяют их активность.

     При диализе образца против дистиллированной воды (или буфера с низкой ионной силой) большая часть IgM выпадает в осадок. Осадок растворяют в фосфатном буфере и проверяют активность антител.  

12.2. Хроматографические методы выделения антител.

     1) Ионнообменная хроматография.

В качестве ионнообменника для выделения антител чаще всего используют DEAE (DiEthylAminoEthyl), прикрепленного к целлюлозе, сефарозе или акриламидным гранулам. При кислых значениях рН (6,5) раствора молекулы IgG не связываются с DEAE, тогда как большинство других сывороточных (асцитных) белков  (особенно, альбумин) связываются с DEAE достаточно прочно.

     2) Гель-фильтрация антител производится  на колонках с агарозой, сефарозой или сефадексом, если речь идет о гельфильтрации при атмосферном давлении, и акриловыми гранулами при высоко эффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HLPC). Разделение идет по молекулярным массам белков, поэтому IgG массой 150кДа достаточно хорошо отделяется от основного загрязнителя- альбумина (65кДа).

     3) Хроматография на протеинах А или G.  

Протеин А (из Stafilococcus aureus) связывает Fc-фрагмент антител с разной эффективностью в зависимости от видовой и классовой (субклассовой) принадлежности антитела. Поэтому, в зависимости от силы связывания протеина А с конкретным монАТ, подбирают условия хроматографии (рН буфера для связывания, ионная сила). Антитела, плохо связывающиеся с протеином А(например, мышиные IgG1), можно выделять на протеине G.

     4) Аффинная хроматография.

При помощи аффинной хроматографии, где к носителю прикреплены молекулы антигена, получаются самые чистые образцы монАТ. Однако, если монАТ имеют очень высокую аффинность, их элюция в неденатурирующих условиях может представлять серьезную проблему. 

Заключение.

     Впервые моноклональные антитела стали использоваться в терапии в 1986 году, но из-за своего мышиного происхождения их применение было очень ограничено. Спустя почти два десятка лет использование монАТ в терапии остается в зачаточном состоянии, несмотря на очевидные успехи в этом направлении. Большим сдерживающим фактором здесь является высокая стоимость производства терапевтических количеств моноклональных антител. Последние новости о работах по созданию трансгенных промышленных животных (коз, овец, коров), продуцирующих человеческие антитела в своем молоке, вселяют надежду на более широкое использование монАТ для лечения инфекционных, опухолевых и аутоиммунных заболеваний.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Источники информации: 

1. http://www.biotechnolog.ru
2. http://www.service-gene.spb.ru
3. http://www.lvrach.ru
4. http://hybridoma.ru
5. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М.: Медицина, 1983
6. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991
7. Егоров Н.С. Биотехнология: учебное пособия для вузов в 8 кн., 1987-1988