Получение и применение моноклональных антител

     Довольно  часто высокий фон наблюдается  в лунке, куда нанесли супернатант от иммунных В-лимфоцитов, не гибридизованных с миеломой. Такой фон хорошо прогнозируется по уровню титра специфических антител в сыворотке животного, используемого как источника В-лимфоцитов. Выходом здесь является смена ростовой среды во всех лунках культурального планшета, производимая столько раз, сколько требуется для удаления большей части антител, секретируемых неслившимися В-лимфоцитами.

     Условия инкубации исследуемых образцов можно варьировать, если хотят повысить чувствительность метода (отношение  сигнал/фон). Для уменьшения фона можно  понизить температуру и уменьшить  время инкубации, использовать во время  инкубации шейкер, для увеличения положительного сигнала время инкубации, напротив, увеличивают. При использовании  светочувствительных антигенов  все процедуры ИФА проводят, по возможности, в темноте или при  красном свете. В случае антигенов, не устойчивых к действию протеолитических ферментов (протеазы могут содержаться  в исследуемых сыворотках и супернатантах как компоненты ростовой среды), в инкубируемые образцы добавляют ингибиторы протеаз (PMSF, aprotinin и др.). 

8.1.5. Инкубирование с мечеными ферментом антителами.  

      Обычные условия инкубации: 1час при 37°С в фосфатно-солевом буфере. В качестве антител, конъюгированных с ферментом, обычно используют очищенную поликлональную сыворотку животных (кролика, козы, овцы, свиньи, морской свинки и др.), гипериммунизированных мышиными антителами или их фрагментами. Если для гипериммунизации берут полную иммуноглобулиновую фракцию сыворотки мыши, то получаемая поликлональная сыворотка будет узнавать все изотипы мышиных антител, с большей чувствительностью IgG1, какдоминантного в мышиной сыворотке.

     В случае, когда хотят получить монАТ определенного класса (например, IgG), берут поликлональные антитела, направленные против иммуноглобулинов этого класса (или подкласса). При этом, однако, возможен отбор монАТ нежелаемых классов, так как такая поликлональная сыворотка будет содержать антитела, направленные против участков, общих для разных классов иммуноглобулинов. Во избежание этого используют сыворотку  против Fc-фрагментов иммуноглобулинов желаемого класса. 

     Качество  конъюгата зависит от способа очистки поликлональных антител. При высаливании сыворотки конъюгат будет содержать помимо антител примесь других белков, а среди выделенных антител будут не только те, что направлены против иммуноглобулинов мыши, но и «посторонние» антитела, что отразится в конечном итоге на степени чувствительности анализа. При очистке с помощью хроматографии на протеине А или протеине G содержание примесных белков будет ниже, но количество «посторонних» антител будет такое же, как при высаливании. Самой качественной считается очистка аффинной хроматографией на мышиных иммуноглобулинах того класса (подкласса), против которого хотят получить конъюгат.

     Все упомянутые виды поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши сегодня представлены на рынке, при их выборе учитывают цели, для которых предполагается их использовать, желаемый уровень чувствительности ИФА и цену.  Ряд лабораторий использует самостоятельно получаемые конъюгаты.

     В качестве фермента для ИФА чаще всего  используют пероксидазу хрена (horseradish peroxidase или HRP), реже щелочную фосфатазу или бета-галактозидазу. Пероксидаза хрена имеет несколько субстратов, все они требуют добавления Н2О2. Для ИФА чаще используют растворимые субстраты ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ), причем ТМБ в последнее время вытесняет ОФД из употребления по причине канцерогенных свойств последнего. Пероксидаза хрена довольно легко конъюгируется с антителами, что, вероятно, и стало причиной ее популярности. Для конъюгирования используют, как правило, периодатный метод, при котором углеводные остатки пероксидазы соединяются с аминогруппами антител через формирование Шиффовых оснований. 

      При инкубации пероксидазного конъюгата нужно избегать присутствия в буфере азида натрия, ингибирующего ферментативную активность пероксидазы. Для  уменьшения неспецифического связывания конъюгата с антигеном в буфер добавляют бычий сывороточный альбумин до концентрации 0,5-1% и Tween 20 (0,05%).  Концентрацию конъюгата определяют экспериментальным путем:

а) в  хорошо изученной системе берут  оптимальное количество антигена для  сорбции и насыщающее количество известных антител против антигена, параллельную дорожку оставляют  без добавления антител;

б) титруют  конъюгат параллельно на дорожке с антителами и на дорожке без антител;

в) считают  отношение сигнала в лунке  с антителами к сигналу в лунке  без антител для каждого разведения конъюгата; выбирают разведение конъюгата, дающее максимальное отношение позитивный сигнал/фон и используют это разведение в дальнейшей работе. Время от времени нужно повторять процедуру определения оптимального рабочего разведения конъюгата, поскольку его активность со временем падает. О том, как нужно обращаться с фирменными конъюгатами, обычно подробно описывается в инструкциях.      

8.1.6. Инкубирование  с ферментными субстратами.

     В настоящее время большинство  лабораторий пользуется коммерческими  наборами субстратов, имеющими подробные  инструкции по их применению. Для пероксидазы хрена это, как правило, сухой ОФД или ТМБ, кислый буфер (цитратный для ОФД или ацетатный для ТМБ) и перекись водорода. Компоненты смешивают непосредственно перед использованием и инкубируют в лунках 10-20 минут до развития окраски (желтой в случае ОФД и голубой для ТМБ). Время инкубации может быть увеличено или уменьшено в зависимости от скорости окрашивания субстрата. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты. Результат оценивают визуально или при помощи спектрофотометра, измеряя оптическую плотность при длине волны 492 нм (для ОФД) или 450 нм (для ТМБ). 

8.2. Радиоиммунный анализ. 

     Почти все сказанное выше в отношении  иммуноферментного анализа можно  отнести и к радиоиммуному анализу. Принципиальным отличием здесь является то, что вместо ферментной метки используют метку радиоактивную, главным образом ¹²⁵I. Наличие сигнала регистрируют, прикладывая к лункам планшета или нитроцеллюлозному листу пленку с чувствительным к излучению слоем, либо вырезают дно лунок планшета (используют специальные гибкие планшеты) или кусочки нитроцеллюлозы и фиксируют наличие излучения при помощи сцинтилляционного счетчика. Радиоиммунный анализ более чувствителен, чем иммуноферментный, однако сейчас он почти не используется по причине своей дороговизны и вредного воздействия изотопов на человека и окружающую среду. 

8.3. Латекс-агглютинация  и метод фиксации комплемента.

     Эти методы целесообразно применять  для скрининга в том случае, если получаемые монАТ предполагается использовать в подобных тест- системах. МонАТ, отобранные иммуноферментным анализом могут плохо работать в гомогенных системах, таких как латекс- агглютинация или метод фиксации комплемента.

При использовании  метода латекс- агглютинации частицы латекса нагружают молекулами антигена, инкубируя их в растворе антигена 30 минут при 56°С. Латекс отмывают от несвязавшегося антигена неоднократным центрифугированием в фосфатно-солевом буфере. Тестируемые пробы смешивают со взвесью латексных частиц в лунках круглодонного 96-луночного планшета, затем центрифугируют или ждут самостоятельного осаждения латексных частиц. Наличие антител против требуемого антигена оценивают по степени агглютинации латекса: при отсутствии антител и, следовательно, агглютинации, латексные частицы собираются на дне лунки в одну точку. При наличии агглютинации частицы оказываются «размазанными» по дну лунки. Диаметр пятна зависит от степени агглютинации и, соответственно, отражает уровень содержания специфических к антигену антител в исследуемой пробе. Для облегчения визуальной оценки реакции используют ярко-окрашенные латексные частицы.

     Явным недостатком метода является необходимость  нагревать антиген, что может  привести к изменению его антигенных свойств. Другим недостатком метода является необходимость тщательного  подбора условий реакции для  каждого конкретного антигена во избежание ложно-положительных реакций. К таким условиям относятся: количество сорбируемого антигена и разведение супернатантов и сывороток, поскольку избыток сывороточных неспецифических антител (особенно класса IgM) может вызвать неспецифическую агглютинацию. Кроме того метод cбольшей чувствительностью определяет антитела класса IgM по сравнению с более желаемыми IgG. К несомненным достоинствам метода можно отнести быстроту его исполнения и низкую стоимость.

     Метод фиксации комплемента имеет много  общего с латекс-агглютинацией; разница состоит в том, что антигеном нагружают не латексные частицы, а живые клетки (как правило, эритроциты барана). Взвесь клеток с молекулами антигена на поверхности смешивают с исследуемой пробой и раствором белков системы комплемента. При наличии в пробе антител к антигену, происходит активация комплемента и, как следствие, лизис клеток, наблюдаемый визуально. Достоинства и недостатки метода фиксации комплемента те же, что и у латекс-агглютинации. 

8.4. Дополнительные  методы скрининга.

     При получении монАТ полезно учитывать их предполагаемое использование и в связи с ним вводить дополнительные методы скрининга, позволяющие отобрать монАТ, максимально пригодные для их применения. Примером здесь может быть скрининг монАТ, влияющих на активность фермента, либо обладающих самостоятельной ферментативной активностью. В этих случаях используют метод, позволяющий оценивать активность фермента в присутствии или в отсутствие тестируемого образца. 

9. Клонирование гибридом. 

     Сразу после обнаружения в лунке  с растущим клоном (или несколькими  клонами) желаемых антител, нужно возможно скорее провести клонирование. Причины, по которым нужно торопиться с  клонированием, такие же, что и  для раннего тестирования первичных  клонов, и были перечислены выше. 

9.1. Метод  клонирования в мягком агаре.

     «Отцы» гибридомной технологии Келер и Мильштейн в своей пионерской работе использовали метод клонирования в мягком агаре. Сегодня этот метод имеет скорее историческое, нежели практическое значение, но из уважения к патриархам гибридомной технологии кратко рассмотрим и его. Гибридомы после процедуры слияния высевали в чашке Петри на стерильном 1%-ом агаре, приготовленном на селективной ростовой среде с аминоптерином. Белые бляшки растущих клонов тестировали на наличие специфических антител, используя метод фиксации комплемента. Те бляшки, вокруг которых наблюдали лизис эритроцитов барана, вырезали скальпелем, клетки суспендировали в ростовой среде и затем вновь высевали на агар. Процедуру повторяли до тех пор, пока не отбирали клоны, стабильно продуцирующие нужные антитела. Такие антитела являются моноклональными, поскольку секретируются клоном, выращенным из одной клетки. 

9.2. Клонирование  методом предельных разведений.

     Самым распространенным сегодня методом  клонирования является метод предельных разведений. Смысл его состоит  в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой  концентрации, чтобы при посеве клеток на планшет в каждой лунке оказалась  бы одна гибридомная клетка. На практике такое недостижимо, даже при самом тщательном расчете в какие-то лунки попадет две или даже большее число клеток, в какие-то не попадет вовсе. Кроме того, не все клетки могут выжить в тяжелых для них условиях одиночества и дать начало жизнеспособному клону. Поэтому делают несколько разных разведений клеток (как правило, три), в первом из них концентрацию клеток берут приблизительно равной 10 клеток на лунку, во втором- одна клетка на лунку, и в третьем- 0,1 на лунку. Приведенные цифры в разных пособиях могут варьировать. Клетки высевают, используя фидерный слой клеток, поскольку у одинокой гибридомной клетки практически нет шансов выжить в лунке.

     Через несколько дней просматривают под  микроскопом все лунки и фиксируют  количество растущих в них клонов. Лунки с одним растущим клоном осматривают особенно тщательно  на предмет отсутствия в них вторых мелких и малозаметных клонов. Затем, когда клоны достигнут достаточного для тестирования размера, проводят скрининг их супернатантов, используя тот же метод, что и для тестирования первичных клонов. Среди клонов, давших при тестировании положительный результат, отбирают самые продуктивные и здоровые на вид и повторяют процедуру клонирования. Если после второго клонирования все протестированные клоны дали положительный результат, самые лучшие из них отбирают для дальнейшей работы (наработки, заморозки и т.д.). В случае обнаружения несекретирующих клонов, что говорит о неустойчивой секреции антител, необходимо повторить клонирование, либо отказаться от дальнейшего использования этого клона. 

9.3. Клонирование  с помощью приборов.

     В последнее время все большую  популярность приобретают микроманипуляторы- приборы, позволяющие под визуальным контролем стерильно перенести одну выбранную клетку из одного культурального планшета в другой. Этот метод особенно удобен, если в лунке с положительно протестированным супернатантом имеется несколько клонов. Прибор позволяет взять из всех, даже самых маленьких клонов по несколько клеток и рассадить их по одной в лунки. Налицо экономия культуральной посуды и ростовых сред.

Другим  прибором, использующимся для клонирования, является упомянутый выше проточный цитофлуориметр. Он может предложенную ему суспензию клеток рассадить по одной клетке в лунки культурального планшета.