Получение и применение моноклональных антител

     После процедуры гибридизации клетки высевают в среде, содержащей аминоптерин, который блокирует основной путь синтеза пуринов. В результате неслившиеся клетки миеломы (и гибриды миелома+миелома) погибают, так как оказываются лишенными и основного (блокированного аминоптерином) и запасного (потерянного в результате мутации) путей синтеза пуринов. Способными к росту оказываются лишь гибриды миелома+лимфоцит, взявшие у исходных лимфоцитов способность к осуществлению запасного пути синтеза пуринов.

     После отмирания основной массы неслившихся клеток ростовую среду постепенно заменяют на свежую, не содержащую аминоптерин, так как он мешает нормальному функционированию клеток. 

7.2.Использование проточного цитофлуориметра.

     Проточный цитофлуориметр позволяет отсортировывать клетки, которые несут на своей поверхности флуоресцентную метку. Использование проточного цитофлуориметра для отбора гибридных клеток состоит в следующем: Смесь иммунных лимфоцитов и клеток миеломы подвергают стандартной процедуре слияния; затем полученную суспензию клеток инкубируют с раствором антигена, против которого хотят получить монАТ, предварительно конъюгированного с флуоресцентной меткой (например, ФИТЦ- флуоресцеинизотиоцианат). В-лимфоциты и гибриды лимфоцит+миелома имеют на своей поверхности молекулы иммуноглобулинов. В том случае, когда эти иммуноглобулины направлены против требуемого антигена, происходит связывание несущих их клеток с антигеном, а через него с флуоресцентной меткой. Затем с помощью прибора отсортировывают меченые клетки от всех остальных и получают популяцию клеток, состоящую в основном из гибридом, секретирующих антитела против желаемого антигена, и неслившихся В-лимфоцитов, не способных к делению.

     Достоинства этого метода селекции по сравнению  с методом селективных сред состоят  в следующем:

а) отбираются не все гибриды лимфоцит+миелома, а только те, которые секретируют антитела к нужному антигену;

б) партнеры для гибридизации могут не быть мутантами (ГФРТ негативными), поэтому этот метод  селекции особенно полезен при получении  биспецифических антител, когда для слияния берут две гибридомы, секретирующие антитела разной специфичности.

Недостатки  метода:

а) далеко не все лаборатории имеют в  своем распоряжении этот весьма дорогостоящий  прибор, требующий к тому же квалифицированного оператора;

б) процедура  гибридизации довольно травматична для клеток, а дополнительные манипуляции с ними после гибридизации неизбежно приведут к большей их гибели. 

8. Скрининг супернатантов гибридом. 

     Через несколько дней после процедуры  слияния заметен рост гибридомных клонов на фоне отмерших неслившихся миеломных клеток и меньших по размеру неделящихся В-лимфоцитов. На 6-14 после слияния день, когда размер клонов обычно достигает нескольких сотен клеток, необходимо протестировать супернатанты гибридом на содержание антител к требуемому антигену (иначе говоря, провести скрининг). Необходимость в раннем скрининге диктуется следующими причинами:

а) после  отмирания неслившейся миеломы популяция делящихся клеток может содержать в себе гибридомы, секретирующие антитела к постороннему антигену либо антитела к требуемому антигену, но неудовлетворительной аффинности;

б) небольшая  часть миеломных клеток может выжить на селективной среде вследствие обращения мутантного гена в нормальный, свободные от секреции такие ревертанты быстро перерастут гибридомы- продуценты антител;

в) после  гибридизации клетки приобретают дополнительный хромосомный набор, что делает клетку генетически неустойчивой. Это приводит к активным геномным перестройкам и  выбросу лишних хромосом в первые дни и недели после гибридизации. Клетка, лишившаяся таким образом  обременительной для себя секреции антител, опередит в росте секретирующие  клетки. 

8.1.Иммуноферментный  анализ.

     Наиболее  распространенным сегодня методом  скрининга является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Общая схема имунноферментного анализа:

1)      прикрепление молекул антигена на дне лунок 96-луночного планшета;

2)      отмывка несвязавшегося антигена;

3)      блокировка мест связывания на планшете, свободных от молекул антигена;

4)      отмывка блокирующего раствора;

5)      инкубация с исследуемыми образцами (например, супернатантами гибридом); в процессе инкубации должно происходить связывание молекул антигена с молекулами антител (если они имеются в исследуемом образце);

6)      отмывка от несвязавшихся с антигеном компонентов исследуемых образцов;

7)      инкубация с раствором конъюгированных с ферментом антител, направленных против предполагаемых антител образца;

8)      отмывка от несвязавшихся конъюгированных с ферментом антител;

9)      инкубация с раствором неокрашенного субстрата фермента до развития окраски вследствие ферментативной реакции;

10)     остановка ферментативной реакции;

11)    оценка интенсивности окраски.

     Приведенная схема отражает лишь один, самый  распространенный вариант иммуноферментного  анализа. Рассмотрим подробнее вышеперечисленные  этапы ИФА: 

8.1.1. Прикрепление (сорбция) антигена.

     Обычно  антиген сорбируют на полистиреновых или поливиниловых 96- луночных планшетах, инкубируя раствор антигена в течение ночи при 4°С или 1-4часа при 37°С. Условия сорбции зависят от природы антигена, большинство растворимых белков хорошо сорбируется в фосфатно-солевом (рН 7,0-7,5) или бикарбонатном (рН 8,5-9,0) буфере в концентрации 1-10мкг/мл. Выбор концентрации антигена определяется его способностью неспецифически взаимодействовать с посторонними компонентами исследуемых образцов и мечеными антителами, а также доступностью антигена.  Пептиды (особенно мелкие) и нуклеиновые кислоты сорбируются значительно хуже белков, а липиды возможно лишь сорбировать высушиванием их в лунках в смеси этанол/хлороформ.

     Клеточные антигены и вирусные частицы можно  сорбировать при обычных для  белков условиях, если клетки или частицы  хорошо очищены от примесей и инкубируются в достаточно высокой концентрации (10⁸ клеток/мл). В ряде случаев приходится прибегать к таким уловкам, как высушивание образцов, фиксация глутаральдегидом, сорбирование на планшеты, предварительно покрытые поли-Л-лизином, и др. Однако, если в образце слишком маленькая концентрация клеток и большое количество посторонних включений, все эти приемы оказываются неэффективными. 

     Низкомолекулярные соединения чаще всего нереально  сорбировать обычной инкубацией, поэтому их, как правило, сорбируют  в составе конъюгата с белком- носителем.

     При сорбции довольно часто происходит частичное или полное искажение  антигенных детерминант, иногда антитела хорошо связывают свободный и  практически не узнают сорбированный  антиген, но чаще наблюдается обратная картина: антитело отлично связывает  сорбированный антиген и почти  или совсем не узнает антиген в  растворе. 

8.1.2. Отмывка  несвязавшихся компонентов растворов.

     Отмывку планшета от несвязавшихся компонентов инкубируемых растворов проводят после каждого этапа инкубации за исключением последнего, когда планшет инкубируют с ферментными субстратами до развития окраски.  Несвязавшиеся вещества отмывают обычно фосфатно- солевым буфером (ФСБ) с добавлением детергента Tween 20 при концентрации последнего 0,05-0,1%. Tween 20 уменьшает уровень неспецифических взаимодействий и способствует забивке свободных мест связывания на планшете. Обычно процедура отмывки производится заполнением лунок планшета отмывающим раствором и последующим резким вытряхиванием этого раствора из перевернутого планшета, и повторяется 3-5 раз после каждой инкубации. Сейчас рынок предлагает целый ряд приборов, частично или полностью автоматизирующих рутинную процедуру отмывки планшетов для ИФА. 

8.1.3. Блокировка (забивка) несвязавшихся участков планшета после сорбции антигена.  

      Применение Tween делает дополнительную забивку необязательной; в тех случаях, когда Tween не используют или его блокирующие свойства не достаточны, производят инкубацию планшета с блокирующим раствором. Таким раствором может быть 0,5-1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ, раствор желатина, казеина, овальбумина, обезжиренное сухое молоко и др. Если антиген проявляет свойства лектина, т.е. связывает определенные углеводы, необходимо добавлять в блокирующий раствор и во все растворы при последующих инкубациях (за исключением последней инкубации с ферментными субстратами) избыток этого углевода, чтобы избежать неспецифического присоединения антигена к углеводному компоненту антител. 

8.1.4. Инкубирование с исследуемыми образцами.

     В качестве исследуемых образцов в  ИФА могут выступать супернатанты гибридом, сыворотки иммунных животных, любые растворы, которые хотят проверить на содержание антител к конкретному антигену. Инкубацию обычно проводят в течение 1 часа при 37°С, но возможны варианты.

     Супернатанты можно наносить в лунки без разведения, но предпочтительнее разбавлять их в соотношении 1:1 в 1%-ом растворе БСА (бычьего сывороточного альбумина) с Tween 20 для уменьшения неспецифического взаимодействия. Если в качестве сорбированного антигена использовался конъюгат с белком носителем, супернатанты полезно наносить в растворе, содержащем избыток белка- носителя, для того, чтобы антитела против носителя с ним связались, затем отмылись и не участвовали в дальнейшем анализе. В такой системе основной вклад в формирование конечного сигнала дают антитела, направленные против гаптена (или линкера), а не носителя.

     Сыворотки почти всегда тестируют, делая их серийные разведения в ФСБ-БСА-Tween. Неразведенные сыворотки содержат слишком большое количество антител и других белков, что неизбежно приведет к слишком большому уровню неспецифического связывания. Полезно параллельно с иммунной сывороткой таким же образом титровать и преиммунную, чтобы оценить уровень неспецифического связывания при каждом разведении сыворотки.

     При нанесении любых тестируемых  образцов на планшете для каждого  антигена должны быть оставлены лунки, лишенные тестируемой пробы (отрицательный  контроль). При тестировании супернатантов таких отрицательных контролей должно быть несколько: во-первых, лунка, содержащая лишь тот буфер, в котором были разведены остальные супернатанты; во-вторых, лунка, содержащая ростовую среду, разведенную этим буфером; в-третьих, лунка, содержащая супернатант иммунных В-лимфоцитов, не подвергшихся процедуре гибридизации с миеломными клетками. Постановка всех этих контролей позволит судить о том, какой вклад в формирование сигнала вносят:

а) неспецифическое  связывание с антигеном антител, меченых ферментом (сигнал в лунке с буфером),

б) неспецифическое  связывание компонентов ростовой среды (сигнал в лунке с ростовой средой),

в) вклад  специфических к антигену антител, секретируемых неслившимися В-лимфоцитами, присутствующими в каждой лунке культурального планшета, куда высевались клетки после слияния.

     Делать  выводы о секреции гибридомой антител против требуемого антигена можно лишь при всех удовлетворительно низких отрицательных контролях.

     В тех случаях, когда сигнал в контрольных  лунках (иначе говоря, фон) слишком  высок, принимают меры, позволяющие  его снизить. Если «фонят» меченые ферментом антитела, снижают их концентрацию и/или меняют буфер, в котором они наносились, и условия инкубации (инкубируют при комнатной температуре вместо 37°С, используют при инкубации шейкер, сокращают время инкубации и т.д.). Иногда помогает снижение концентрации сорбированного антигена. При неэффективности этих мер пробуют использовать меченые антитела из других источников, либо другого происхождения (например, кроличьи заменяют козьими или свиными), либо несущие другую ферментную метку. Проверку меченых антител и подбор условий инкубирования производят заблаговременно.

     Компоненты  ростовой среды редко влияют на уровень  фона, основной вклад здесь вносят белки (особенно иммуноглобулины и  комплемент), содержащиеся в эмбриональной  телячьей сыворотке. В таком случае обычно помогает уменьшение концентрации сорбируемого антигена.