Термофильная микробная металлоредукция

К началу исследований в 1993 г. о существовании  микробных процессов диссимиляционного восстановления Fe(III), идущих при повышенных температурах известно не было. О восстановлении трёхвалентного железа термофильным археоном Sulfolobus acidocaldarius в микроаэрофильных условиях сообщалось Броком и Густафсоном в 1976 году (Brock & Gustafson 1976). Полученные данные демонстрировали биотический характер восстановления железа, однако, не позволяли однозначно судить об использовании Fe(III) в качестве акцептора электронов при росте данного микроорганизма. В 1995 г. были опубликованы данные, доказывающие существование диссимиляционного процесса восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами, идущего с образованием магнетита (Слободкин и др. 1995). В том же году появилось сообщение о выделении облигатно анаэробной бактерии Bacillus infernus, способной восстанавливать растворимые формы Fe(III) (Boone et al 1995). В последующие годы круг организмов, осуществляющих диссимиляционную железоредукцию, был расширен термофилами, выделенными из различных мест обитания (Greene et al. 1997, Slobodkin et al 1997, Slobodkin et al. 1999). Способность к восстановлению Fe(III) была выявлена у некоторых коллекционных культур гипертермофильных микроорганизмов, относящихся к различным физиологическим и филогенетическим группам бактерий и архей (Vagras et al. 1998). На основании этого была выдвинута гипотеза о том, что такое широкое распространение способности к железоредукции среди гипертермофильных прокариот, которых принято считать филогенетически близкими к последнему общему предку всех живых организмов, указывает на то, что восстановление Fe(III) является древнейшим типом метаболизма.

К настоящему времени известно около 30 видов железовосстанавливающих термофилов, относящихся к 19 родам. Важными открытиями последних лет явились обнаружение способности гипертермофильных архей к использованию ацетата, ароматических соединений и длинноцепочечных жирных кислот за счёт восстановления Fe(III) (Tor et al. 2001, Tor & Lovley 2001, Kashefi et al. 2002) и выделение железоредуктора, способного развиваться при температуре 121^oC (Kashefi & Lovley 2003). Быстрыми темпами увеличиваются знания о филогенетическом разнообразии термофильных железоредукторов (Reysenbach et al. 2006, Johnson et al. 2006, Zavarzina et al. 2007, Sokolova et al. 2007).

Кроме Fe(III) термофильные микроорганизмы восстанавливают и ряд других переменно-валентных металлов - Mn(IV), Cr(VI), U(VI), Tc(VII), Co(III), Mo(VI), Au(I, III), Hg(II). Марганец(IV) и молибден(VI), используются в качестве акцептора электронов при росте (Greene et al. 1997, Brierley & Brierley 1982). Использование шестивалентного урана в качестве терминального акцептора электронов при росте показано нами в 2005 г. (Khijniak et al., 2005). Физиологическая роль восстановления остальных металлов остаётся в основном невыясненной (Kashefi & Lovley 2000, Roh et al. 2002).

 

 

1.3 Область применения

 

Микробная железоредукция оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека. Биокоррозия, оглеение почв, удаление органических загрязнителей и иммобилизация токсичных металлов в грунтовых водах, микробные топливные элементы.

Железовосстанавливающие микроорганизмы способны восстанавливать и ряд других элементов переменных валентностей, включая токсичные металлы и радионуклиды. При восстановлении хрома, технеция, урана образуются слаборастворимые соединения, что может быть использовано для их иммобилизации в биотехнологических процессах или при биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, имеют потенциал для применения в современных нанотехнологиях (Lloyd 2003).

Термофилы – прошлое планеты,будущее биотехнологии

Термофилы – микроорганизмы, которые способны активно развиваться в таких  непригодных для жизни условиях, как крайне высокие температуры  и скопления отравляющего угарного газа, что характерно для нефтяных месторождений, гейзеров, горячих источников вулканических зон. Многие термофилы  растут анаэробно (без кислорода) и  используют для дыхания разные газы, в том числе угарный, а также могут восстанавливать железо, серу и некоторые другие материалы.

Лаборатория гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН занимает в России ведущие позиции по изучению этих удивительных микроорганизмов. Основа практического интереса к термофилам — их ферменты. Сфера применения ферментов из термофилов довольно широка: молекулярная биология, текстильная, целлюлозно-бумажная и пищевая промышленность, производство моющих средств, пищевых продуктов, кормов, переработка различных отходов. В этих областях можно ещё совершить настоящий прорыв, убеждены учёные. В процессе анаэробного дыхания термофильные микроорганизмы способны восстанавливать различные металлы с переменной валентностью, скажем, железо. Эту способность термофильных микроорганизмов можно использовать в технологиях очистки промышленных стоков от токсичных металлов или радионуклидов.

В этом году перед исследователями  стоит новая задача, связанная  с получением «микробного электричества» - поиск в горячих источниках электрогенных сообществ микроорганизмов. Идея существования «микробных топливных элементов» (microbial fuel cells) была сформулирована в середине 90-х. Одним из её основоположников стал американский микробиолог Дерек Лавли, специализирующийся на микроорганизмах, которые восстанавливают нерастворимое железо. Из-за того, что оксиды железа плохо растворяются, в ходе эволюции у микроорганизмов выработались высокоэффективные механизмы переноса электронов на твёрдое вещество-акцептор. Суть получения «микробного электричества» - «обмануть» бактерии, подменив железо необходимым исследователю материалом. Если поместить культуру микроорганизмов на анод топливного элемента, то он вместо железа будет получать электроны от ферментных систем клетки. За счёт этих электронов в топливном элементе потечёт электрический ток. Таким образом, можно говорить о создании именно «микробного» топливного элемента, иначе говоря, «микробной батарейки».

В лаборатории гипертермофильных микробных сообществ уже есть модельные термофильные топливные элементы. «Гидротермальные системы обладают электрохимическими характеристиками, позволяющими создавать на их основе микробные топливные элементы с высокими значениями мощности и удельной плотности тока. Пока можно сказать наверняка: энергетическая эффективность микробиологических топливных элементов при повышенных температурах выше, чем в обычных условиях. Наши полевые эксперименты в гидротермах кальдеры Узон на Камчатке показали возможность развития электрогенных консорциумов термофильных микроорганизмов в виде обрастаний на анодах топливных элементов» - говорит научный сотрудник лаборатории Сергей Гаврилов.

Исчерпав  ресурсы, человечество лишиться нефти, газа и угля, на образование которых  уходят сотни миллионов лет. Расцвет  «нефтяной эры» цивилизации близится к концу. Поэтому все пристальнее  внимание науки к вопросам получения  энергии различными способами, в  том числе и столь нетрадиционными, как при участии термофилов. Кальдера Узон - это одно из наиболее перспективных в биотехнологическом отношении резерватов для сохранения и естественного воспроизводства микробных генетических ресурсов для науки XXI века.

 

 

 

 

 

 

 

2. Результаты исследований

2.1 Оборудование  и материалы, цели

 

                                                      Цели исследования.

1) Изучить влияние различных  температур на рост и развитие  единичных клеток и популяция  микроорганизмов. 

2) Изучить особенности  морфологического строения колоний  микроорганизмов.

                                        Оборудование и материалы.

1. Микроскоп МИКМЕД-I

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Питательные среды на  чашках: МПА.

5. Чашки Петри с культурами  микроорганизмов.

6. Микробиологические петли  и иглы.

7. Стеклянные пробирки  вместимостью 15 мл., пипетки вместимостью 1,0 и 5,0 с делениями, шпатель, стандартная миллиардная суспензия микроорганизмов.

 

 

2.2 Ход работы

1) Приготовили миллиардную  суспензию микроорганизмов по  стандарту мутности.

2) Сделали ряд последовательных  разведений до 10⁻⁶.

3) Выполнили посев микробной  суспензии на плотную питательную  среду в чашки Петри  из  разведения 10⁻⁶.

4) Готовые чашки Петри  промаркировали с указанием значения  показателя высеваемой концентрации  клеток, температуры и фамилии  студента.

5) Затем чашки поместили  в термостат при температуре  37 С  ̊, в холодильник при температуре 4 С ̊и оставили при комнатной температуре (24 С ̊).

6) На следующем занятии  описали колонии по данной  схеме:

- диаметр колонии –  точечные (D – меньше 1 мм), мелкие (D – 1-2 мм), средние (D – 2-4 мм), и крупные (D – 4-6 мм и более).

- форма колонии - округлая, амебовидная, ризоидная.

- оптические свойства  – прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая.

- цвет – отмечают цвет  колонии и выделение пигмента  в среду.

- поверхность – гладкая,  шероховатая, складчатая, бугристая. 

- профиль – плоский,  выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и т. д.

- край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и т. д.

- консистенция – маслянистая,  тестообразная, вязкая, пленчатая.

 

2.3 Результаты  работы

Таблица 1. Характеристика колоний  Bacillus cereus.

Темп. выращивания	Характер роста	Количество колоний	Морфология колоний
			диаметр, мм	форма	Оптические свойства	цвет	поверхность	профиль	Край колонии	консистенция
37 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-
24 С  ̊	Отдельные  колонии	11	< 1 мм.	округлая	Непрозрачная блестящая	молочный	гладкая	выпуклый	ровный	тестообразная
4 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 2. Характеристика колоний  Sarcina Hava.

Темп. выращивания	Характер роста	Количество колоний	Морфология колоний
			диаметр, мм	форма	Оптические свойства	цвет	поверхность	профиль	Край колонии	консистенция
37 С  ̊	Отдельные колонии	120	4-6 мм.	округлая	Непрозрачная, блестящая	жёлтый	гладкая	выпуклый	ровный	тестообразная
24 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-
4 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Таблица 3. Характеристика колоний  Escherichia coli.

Темп. выращивания	Характер роста	Количество колоний	Морфология колоний
			диаметр, мм	форма	Оптические свойства	цвет	поверхность	профиль	Край колонии	консистенция
37 С  ̊	Отдельные колонии	4	2-3 мм.	округлая	Непрозрачная, блестящая	Жёлто-зеленый	шероховатая	выпуклый	ровный	тестообразная
24 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-
4 С  ̊	Рост отсутствует	-	-	-	-	-	-	-	-	-