Термофильная микробная металлоредукция

Мембраны в клетке служат не только границей раздела фаз, но и местом локализации ряда важнейших  биологических систем. В настоящее  время имеются данные, указывающие, что некоторые ферменты термофилов приобретают термостабильность, когда они связаны с клеточной мембраной. Если их отделить от мембраны с помощью ультразвука, то эти ферменты становятся относительно термолабильными.

Мембраны термофильных бактерий отличаются высокой механической прочностью.

Было показано, что многие облигатно-термо-фильные бактерии (Вас. stearothermophilus, Вас. coagulans, Вас. denitrificans) способны образовывать шаровидные протопласты при развитии сначала в интенсивно аэрируемой среде, а затем (в фазе экспоненциального роста) без аэрации.

Одним из главных факторов, вызывающих процесс образования  протопластов, является резкий дефицит  кислорода в среде. Образовавшиеся в этих условиях протопласты могут  длительное время не лизироваться в обычных условиях, что свидетельствует об их значительной осмотической устойчивости.

Рибосомы, выделенные из клеток облигатно-термофильных бактерий, обладают значительно большей термостабильностью, чем рибосомы, выделенные из клеток мезофильных форм. Высказывается предположение, что наибольшая стабильность рибосом у термофилов может быть благодаря различиям в составе и структуре рибосомальных протеинов.

Интересно привести данные, полученные при изучении термостабильности рибосом у Thermus aquaticus, оптимальная температура роста которой равна 70 °С.

Рибосомы грамотрицательной  палочки Thermus aquaticus были устойчивы при нагревании до 79 °С, а рибосомы Bacterium coli разрушались при увеличении температуры до 59 °С. Температура денатурации рибосом Т. aquaticus коррелирует с максимальной температурой роста этой бактерии, также равной 79 °С. Рибосомы грамцоложительной термофильной бациллы Вас. stearothermophilus денатурировались при температуре 72 °С.

Химический состав рибосом  Т. aquaticus следующий: 59% белка и 41% РНК. По процентному содержанию этих компонентов рибосомы Т. aquaticus заметно отличались от рибосом грамотрицательной бактерии В. coli, которая состояла из 41% белка и 59% РНК. Увеличение содержания белка, по-видимому, обеспечивает повышенную термостабильность рибосом культуры Т. aquaticus.

При изучении нуклеотидного  состава рибо-сомальной РНК, выделенной из клеток Т. aquaticus, Вас. stearothermophilus и В. coli, было выявлено повышенное содержание гуанина и цитозина в молекуле РНК Т. aquaticus и Вас. stearothermophilus по сравнению с РНК, выделенной из В. coli.

Рибосомальная РНК, выделенная из клеток термофильных бактерий, более устойчива к действию рибосомальной рибонуклеазы, чем РНК, выделенная из мезофильных форм микроорганизмов.

Интересно было сравнить термоустойчивость рибосом Т. aquaticus и В. coli с терморезистентностью выделенных из этих рибосом рибосомальных РНК. Отмечено, что, хотя рибосо-мальная РНК Т. aquaticus более термоустойчива, чем р-РНК В. coli, обе изолированные из рибосом р-РНК были значительно менее термостабильными, чем интактные рибосомы этих же микроорганизмов.

Те клеточные элементы, которые у термофилов термолабильны (транспортная РНК), способны быстро восстанавливаться после их разрушения или инактивации. В. Бабелаи И. Холдстворт установили, что оборачиваемость т-РНК в клетках термофилов гораздо выше, чем у мезофильных форм; этим обеспечивается более высокая скорость синтеза протеинов термофилами. По данным С. М. Фридман и И. Б. Вайнштейн, фермент аминоацил-т-РНК-синтетаза, выделенный из термофильной бактерии Вас. stearothermophilus, обладает высокой термостабильностыо, сама же т-РНК термолабильна.

Таким образом, клетки термофилов способны к быстрому ресинтезу разрушенных и инак-тивированных клеточных компонентов. С другой стороны, т-РНК экстремально-термофильной бактерии Т. aquaticus была более термо-стабилъной и не подвергалась денатурации при 68 °С, в то время как т-РНК В. coli была стабильной только до 55 °С.

Вероятно, высокая термостабильность т-РНК Т. aquaticus, так же как и р-РНК, связана с повышенным содержанием в ее молекуле гуанина и цитозина в сравнении с более низкими концентрациями этих оснований в т-РНК В. coli и Вас. stearothermophilus.

Различные ферментные системы, а также отдельные ферменты термофилов неодинаково устойчивы к действию высокой температуры. Наиболее устойчивы  гидролитические ферменты. По степени  термостабильности Л. Л. К э м п -белл и Б. Пейс разделяют ферменты на три группы. Среди них наиболее стабильными являются а-амилаза, протеаза, ферменты, активирующие аминокислоты.

Высокой терморезистентностью отличаются аминоацилирующие ферменты, принимающие участие в синтезе белка экстремально-термофильной бактерии Т. aquaticus. Эти ферменты были более термостабильными и биологически активными при оптимальной температуре их действия, равной 70°С, чем те же ферменты В. coli при 45 °С. На высокую степень биологической активности аминоацилсинтетаз Т. aquaticus указывает тот факт, что процесс аминоацилирования у Т. aquaticus заканчивается в первые 3 мин, а у В. coli полное ами-ноацилирование наступало через 6 мин.

Эти данные согласуются с  результатами исследователей, изучавших  свойства аминоацилт-РНК-синтетаз облигатно-термофильной бактерии Вас. stearothermophilus. Этот фермент был биологически активен при более высокой температуре (55 °С), чем взятый для сравнения фермент из В. coli (37 °С). Однако некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что высокий температурный оптимум для ами-ноацилирования у Вас. stearothermophilus не является необходимым. Б. Бабела и И. Холд-сворт сообщили о потере 50% активности аминоацилсинтетазы Вас. stearothermophilus после инкубирования этого фермента при температуре 60 °С в течение 10 мин. Термостабильность аминоацилсинтетазы Вас. stearothermophilus оказалась низкой при температуре, близкой к оптимальной температуре роста указанного микроорганизма. В противоположность этому у Т. aquations обнаружена хорошая корреляция между температурным оптимумом ами-ноацилирования и оптимальной температурой роста, равной 70 °С.

Из экстремально-термофильной бактерии (штамм АТ-62) был выделен  фермент аспарто-киназа. Этот фермент катализирует образование таких аминокислот, как лизин, треонин и изолейцин. Аспартокиназа очень термостабильна. Максимально активен этот фермент при 70 °С, что коррелирует с оптимальной температурой роста указанного штамма бактерии.

Фермент фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза  был выделен из бактерии Т. aquaticus. Температурный оптимум действия этого фермента около 95 °С; он стабилен при 80 °С в течение 1 ч в отсутствие субстрата и при низкой концентрации белка. Значительный интерес представляет сравнение терморезистентности фрук-тозо-1,6-дифосфатальдолаз, выделенных из клеток Т. aquaticus и Вас. stearothermophilus. Оба фермента термостабильны, но фермент, выделенный из Т. aquaticus, был более устойчив к прогреву. Так, указанный фермент, выделенный из Вас. stearothermophilus, инактиви-ровался при 75 °С, а фермент, выделенный из клеток Т. aquaticus УТ-1, был стабилен при 97 °С.

Ферменты гликолитического превращения глюкозы — фосфофруктокиназа и фосфоглюко-мутаза — были выделены японскими исследователями из клеток экстремально-термофильной бактерии Flavobacterium thermophilus НВ-8. Эти ферменты термостабильны. Так, фосфофруктокиназа не инактивировалась в течение 1 ч при 80 °С, и за то же время потеря активности составила всего 10% при температуре прогрева, равной 90 °С. Фосфоглюкомута-за была стабильна при 85 °С. Такая высокая термоустойчивость этих ферментов — одно из характерных свойств экстремально-термофильных бактерий. Эти ферменты играют важную роль в регуляции углеводного обмена при высоких температурах.

Среди различных гидролитических  ферментов, выделенных из термофильных микроорганизмов, развивающихся при 55—65 °С, наиболее изучена а-амилаза. Она не инактивиру-ется после 24-часовой выдержки при 65 — 70 °С. Активность этого фермента утрачивалась на 29% от первоначальной лишь после суточной выдержки при 85 °С. Высокая термостабильность а-амилазы обусловлена повышенным содержанием ионов кальция в ее молекуле, а также повышенной стойкостью к агентам, разрушающим водородные связи, а-амилаза была выделена из облигатно-термофильной бактерии Вас. circulans 186 с оптимальной температурой развития 56 °С и термотолерантного штамма Вас. subtilis 110 с оптимальной температурой развития 50 °С. Наиболее высокой термостабильностью обладает а-амилаза облигат-но-термофильного штамма Вас. circulans 186. Инкубация этого фермента при 65 °С в течение 5 ч приводит к снижению активности на 85%. Полная потеря активности в этих же условиях наблюдалась у а-амилазы, выделенной из мезо-фильной культуры Вас. subtilis.

Обнаружены различия в  аминокислотном составе а-амилазы термофильных и мезофильных форм микробов. Содержание глютаминовой и аспарагиновой аминокислот в я-амилазах термофильных штаммов больше, чем в а-ами-лазах мезофилов. Как известно, эти аминокислоты могут легко связываться с ионами кальция.

Многие исследователи  предполагают, что кальций стабилизирует  вторичную и третичную структуру  а-амилазы. Было установлено, что существует зависимость между оптимальной температурой роста бактерий и молекулярной массой выделенной из них а-амилазы. Так, а-амилаза, выделенная из Вас. circulans штамм 186, имеет молекулярный вес около 17 000; у а-амилазы, выделенной из Вас. subtilis штамм 110 (с пониженным температурным оптимумом развития), молекулярный вес оказался 28 000—30 000; а-амилаза, выделенная из различных форм мезофильных бактерий Вас. subtilis, имеет молекулярный вес 48 000— 50 000.

В настоящее время интенсивно изучаются особенности термостабильной протеазы. Проводятся глубокие исследования по изучению структуры и физико-химических свойств этого фермента, выделенного из различных форы термофильных микроорганизмов.

Так, был выделен термофильный актиномицет Micromonospora vulgaris штамм 42, развивающийся при 53—55 °С и активно синтезирующий протеазу. Изучены условия культивирования актиномицета и свойства протеолитических ферментов, которые он синтезирует. Выяснилось, что протеаза имеет четыре оптимума, в зависимости от рН раствора. Полученные в чистом виде препараты нейтральных протеаз из культуры актиномицета обладали повышенной термостабильностью и отличались от нейтральных протеаз, выделенных из мезофиль-ных микроорганизмов, рядом физико-химических свойств и специфичностью действия. Из указанного препарата протеаз было выделено два гомогенных препарата, которые заметно отличались своими свойствами. Молекулярный вес одной из протеаз около 50 000, температурный оптимум роста 75 °С. Другая протеаза имела молекулярный вес около 30000, температурный оптимум роста 62—65 °С. Наиболее высокой активностью обладала протеаза с молекулярным весом 50 000.

Многие свойства облигатно-термофильных микроорганизмов закреплены наследственно, и эти формы не могут существовать при перенесении их в обычные  температурные условия.

Споры термофильных микроорганизмов  обладают значительно большей термоустойчивостью, чем споры мезофильных форм. Предполагают, что повышенная устойчивость спор термофилов к высокой температуре объясняется увеличенным содержанием в них дипико-линовой кислоты, а также уменьшением отношения количества магния к кальцию. Отмечено увеличение содержания в спорах термофильной бактерии Вас. stearothermophilus ли-пидов.

Термофильные бактерии широко распространены в природе. Их можно  выделить из почвы, торфа, ила, воды, компоста, навоза и т. д. Но не всегда эти организмы  развиваются в термофильных зонах. Однако наиболее интенсивное развитие термофилов наблюдается в местах, подвергающихся воздействию высоких  температур. Особенно это касается бактерий, которые не способны развиваться  при температуре ниже 40 °С. Эти  бактерии называются обли-гатно-термофильными, имеют температурный оптимум роста 55—65 °С и выше.

В значительных количествах  термофильные бактерии обнаруживаются в огородных и полевых почвах, куда они попадают в основном вместе с органическими удобрениями. Было показано, что в окультуренных  почвах термофилов довольно много, а  в необработанных почвах их почти  нет. Эти наблюдения дали возможность  использовать термофильные микроорганизмы в качестве показателей степени  окультуренности почв. Однако термофильные микроорганизмы были обнаружены даже в почвах и водах Крайнего Севера.

По сравнению с почвой такие субстраты, как сточные  воды, компост, навоз, самонагревающиеся  торф и сено, содержат большее количество термофильных бактерий. Самонагревание сена и торфа, которое иногда приводит к пожару, в значительной мере обусловливается  развитием термофилов. Наличие термофильных микроорганизмов в кишечном тракте и экскрементах животных и человека отмечено многими исследователями.

Интересно отметить, что  такие продукты, как нефть и  входящие в ее состав вещества, также  могут усваиваться термофильными  микроорганизмами.

Широко распространены термофильные суль-фатвосстанавливающие бактерии, оптимальная температура роста которых достигает 55—60 °С. Известны также термофильные бактерии, окисляющие различные соединения серы до молекулярной серы и серной кислоты. Горячие источники, богатые сероводородом, изобилуют термофильными видами тионовых бактерий. Из Брагунских терм (Северный Кавказ) с температурой 89—90 °С выделена тиобактерия Thiobacillus thermophilica Imschenetskii. Оптимальная температура роста этой бактерии 55 — 60 °С, максимальная — около 80 °С, минимальная 40 °С.

С. И. Кузнецов в 1955 г. обнаружил, что в источниках Камчатки с температурой 90—98 °С развиваются термофильные бактерии. В 1967 —1971 гг. американскими исследователями были выделены из субтермальных вод с температурой 85—89 °С бактерии, не образующие спор, которые не способны развиваться при температуре ниже 40—45 °С, они относятся к виду Thermus aquaticus. Температурный оптимум развития этих бактерий 70—80 °С.

Термофильные анаэробные бактерии рода Clostridium были обнаружены во всех обследованных пробах воды и почв, взятых в термальных зонах, а также в компостах.

1.1.4 Экстремально-термофильные  бактерии

В последние годы американскими  исследователями Т. Д. Броком и X. Фризом была описана новая группа бактерий — экстремальные термофилы, в которую вошли виды, способные развиваться при крайне высоких (экстремальных) температурах. Эти формы выделены из различных термальных источников, вода которых имела температуру 85—95 °С и слабощелочную реакцию.

Бактерии — неподвижные  грамотрицательные палочки; оптимальная  температура развития 70 °С. Они описаны  как виды нового рода термус (Thermus). Позднее подобные формы бактерий были найдены многими исследователями.