Термофильная микробная металлоредукция

Как известно, при повышении  температуры изменяется характер воздействия  на клетку ряда физических и химических факторов. Так, при высокой температуре уменьшаются вязкость и увеличивается степень ионизации воды, уменьшается растворимость кислорода и других газов в водной среде, ускоряется течение химических реакций и т. д. Брок указывает, что в подобных условиях существования происходит эволюционная адаптация, при которой организм полностью зависит от определенного значения решающего фактора, летального (губительно действующего) на другие микроорганизмы.

По мере повышения температуры  разнообразие обнаруживаемых групп  различных микроорганизмов сужается. Первыми исчезают наиболее сложные  по строению организмы. Высокие температуры  хорошо переносят только бактерии.

В большинстве случаев  при экстремальных условиях (в  частности, при наиболее высоких  температурах, 80—90 °С) существующие микроорганизмы приближаются к чистой культуре в  местах обитания, т. е. к одному виду. Необходимо отметить, что в источниках с высокой температурой часто  обнаруживаются наряду с указанными бактериями также и термофильные водоросли. Такие водоросли благодаря  их способности фиксировать углекислый газ и молекулярный азот могут  развиваться в воде горячих источников с низким содержанием органических веществ. По-видимому, углерод и азот органических соединений, содержащихся в водорослях, ассимилируется бактериями. Эта зависимость развития бактерий от контакта с водорослями может быть, по мнению Б рока, настолько велика, что без водорослей в горячих источниках с низким содержанием органических веществ рост бактерий становился бы невозможным.

Способность неспорообразующих бактерий, обитающих в горячих источниках, существовать в природе при температуре от 40 до 93 °С и выше дает основание для выделения этих микроорганизмов в новую группу экстремально-термофильных бактерий. Сверхтермофиль-ность этих бактерий по сравнению с облигатно-термофильными бациллами характеризуется более высокими температурными параметрами роста. Указанная группа экстремально-термофильных бактерий специфическая, что обусловлено местом обитания этих микроорганизмов.

Thermus aquaticus широко распространен в природе. Бактерии этого нового вида плохо развиваются при 55 °С, температурный минимум роста 42 °С, при 40 °С рост не отмечен. Оптимальная температура роста 70 °С, максимальная 79 °С. Эти бактерии являются обли-гатными аэробами. Оптимум рН роста 7,5—7,8. Культура имеет желтую или оранжевую окраску. Размер палочек 0,5 X 5 — 10 мкм.

При температурах выше и  ниже оптимальной рост происходит при образовании длинных нитей.

Из различных горячих  источников были выделены бактерии подобного  вида, способные расти при 84 °С и даже при 91 °С; клетки их бледно-желтого цвета. Выделены также бактерии, не образующие пигмента; температурный диапазон развития их от 40 до 80 °С, оптимальная температура роста 69—71 °С.

 

1.1.5 Спорообразующие  аэробные термофильные бактерии

 

Эти формы бактерий, как  указывалось выше, широко распространены в природе. Многие мезофильные виды бацилл имеют своих аналогов среди термофилов.

 
Рис. 3. Термофильная бактерия Вас. stearotliermophilus. Увел. X 3000.

В настоящее время известно всего лишь два самостоятельных  вида термофильных спо-рообразующих бактерий — Вас. stearother-mophilus и Вас. coagulans. Клетки Вас. stearo-thermophilus представлены на рисунке 189.

Процессы роста и размножения  у термофильных микроорганизмов  проходят с большей скоростью, чем  у мезофильных форм микробов. У облигатно-термофильных бактерий, которые не способны развиваться при температурах ниже 37—40 °С и имеют оптимальную температуру роста 55—65 °С, весь цикл развития проходит за 5—8 ч.

Скорость роста мезофильных культур по сравнению со скоростью роста термофилов значительно ниже.

Продолжительность фазы интенсивного роста (лаг-фаза) облигатно-термофильных бактерий чрезвычайно коротка. Продолжительность  лаг-фазы термофильных микроорганизмов меньше, чем мезофильных. Так, у Вас. coagulans наименьшая продолжительность лаг-фазы равна 15 мин при 65 °С роста культуры и 20— 25 мин при 55 °С.

Максимальное количество клеток, накапливаемое в культурах  облигатно-термофиль-ных бактерий, колеблется в пределах 109— 1,3-109 на 1 мл при 55—60 °С и снижается до 6.Ю8-8-108 при 65-70 °С.

 

1.1.6 Анаэробные  термофильные бактерии

 

Значительную часть спороносных  термофильных бактерий составляют анаэробные виды. Известны облигатно-термофильные масляно-кислые, целлюлозные, десульфурирующие и метанобразующие бактерии.

Термофильные целлюлозные  бактерии. Этих бактерий обнаруживают обычно в компостах, разлагающихся  растительных отбросах, илах и т. д. В таких субстратах эти бактерии наряду с термофильными целлюлозоразлагающими грибами и актиномицетами находят благоприятные условия для своего развития. Когда температура поднимается до 60—65 °С, физиологическая активность грибов и актиномицетов резко снижается и разрушение клетчатки полностью осуществляется бактериями.

Развитие целлюлозных  бактерий можно заметить сначала  по газообразованию, затем по разрушению клетчатки (фильтровальной бумаги) и  появлению желто-оранжевого пигмента.

Чистые культуры этих бактерий получить довольно трудно, и это  удавалось немногим исследователям. Типичным мезофильным представителем является бактеррш Bacillus omeli-anskii, названная в честь В. Л. Омелянского, впервые описавшего этот микроорганизм. В качестве типичного термофильного представителя можно назвать Clostridium thermocellulaseum. Описания мезофильных и термофильных видов указанных бактерий тождественны, поэтому А. А. Имшенецкий считает, что они представляют один вид. При этом термофилы могут рассматриваться как варианты мезофилов.

Морфологически целлюлозные  бактерии представляют собой тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, часто с округлыми спорами  на концах клеток. Палочки подвижны, жгутики расположены по всей поверхности  клетки.

Продуктами обмена веществ  анаэробных целлюлозных бактерий, выделяющимися  в окружающую среду, являются водород, углекислый газ, этиловый спирт, глицерин, муравьиная, уксусная, молочная, янтарная, яблочная и фумаровая кислоты. Присутствуют также следы ацетальдегида, иногда — масляная кислота. Эти бактерии разлагают целлюлозу до низкомолекулярных углеводов, главным образом до целлобиозы и глюкозы. Гидролиз целлюлозы сопровождается появлением в среде фермента целлюлазы.

Термофильные метановые  бактерии могут сопутствовать анаэробным целлюлозным бактериям или культивироваться совместно с ними. В начале этого  века Ц. К о-олхаасом впервые были описаны термофильные метановые бактерии с температурными границами развития 45—69 °С. Наиболее типичными видами являются Methanobacterium soehngenii и Methanobacillus omelianskii. Эти бактерии представляют собой тонкие, прямые или слегка изогнутые неспороносные палочки.

Термофильные десульфурирующие бактерии нередко сопутствуют термофильным целлюлозным бактериям. При высоких температурах восстановление сульфатов осуществляется бактерией Desulfotomaculum nigrificans, которая представляет собой палочки с округлыми концами, иногда чечевицевидные и вздутые, подвижные, пери-трихи. Споры овальные, субтерминальные или терминальные.

 

1.1.7 Практическое  значение термофильных бактений и актиномицетов

 

Термофильные бактерии используют для получения микробной биомассы, очистки сточных вод. Ценными  являются продукты обмена веществ термофилов, выделяющиеся в окружающую среду. Эти  микроорганизмы продуцируют такие  физиологически активные вещества, как  антибиотики, витамины, ферменты.

Обычно для получения  микробной биомассы используют термотолерантные дрожжи. Их выращивают на средах, содержащих углеводы (сусловые среды), некоторые спирты или углеводороды нормального строения (н-алканы). В последнее время для этих целей применяют и термофильные бактерии.

Выросшая микробная биомасса вполне полноценна в пищевом отношении: содержит 40— 60% белка, незаменимые аминокислоты, разнообразные витамины. Высушенная биомасса (в виде муки) — белково-витаминный концентрат (БВК) — в небольшом  количестве добавляется к пищевому рациону животных.

Продукты обмена веществ  термофильных бактерий нашли широкое  применение в промышленности. Так, молочнокислые  бактерии Bact. delbruckii используются как активные кислото-образователи. Еще в 1923 г. В. М. Шапошникову и А. Я. Мантейфель удалось наладить производство молочной кислоты с помощью термофильных бактерий. Ряд термофильных молочнокислых бактерий применяется в молочной промышленности для получения высококачественного творога.

Из различных физиологически активных веществ, продуцируемых термофильными  микроорганизмами и используемых в  практике, огромное значение имеют  ферменты.

Список ферментов, продуцируемых  термофильными микроорганизмами и  применяемых в промышленности, очень  обширен.

Так, в текстильной промышленности А. А. Имшенецким с сотрудниками была применена амилаза. Этот фермент  образовывала термофильная бактерия Вас. diastaticus. Амилаза используется и в спиртовой промышленности для размягчения зерновых и картофельных сред при высоких температурах.

Протеазы применяют для  переработки сырья животного  происхождения (обезволашивания кожи, получения клея и т. д.). Выделены и изучены термофильные актиномицеты, активно образующие протеолитические и амилолитические ферменты, комплекс целлюлозе- и гемицеллюлозолитических ферментов.

Для получения целлюлолитических ферментов пытались использовать термофильные анаэробные бактерии и актиномицеты. С помощью целлюлолитических ферментов можно повысить питательную ценность грубых кормов для животных, осахаривать сульфатную целлюлозу до глюкозы, получая таким образом из непищевого сырья ценный питательный продукт. Эти ферменты способны расщеплять полисахариды одревесневших, растительных материалов (шелуха злаковых культур, подсолнечная лузга) до Сахаров (глюкозы и ксилозы). Следовательно, открывается возможность замены кислотного гидролиза древесины и различных отходов ферментативным гидролизом. При этом полностью ликвидируются расход минеральных кислот и необходимость применения высоких температур и давлений при превращении целлюлозы в сахара.

Чешские ученые используют термофильные грибы и актиномицеты, которые продуцируют разлагающие  целлюлозу ферменты, для воздействия  на различные субстраты.

Л. Г. Логиновой выделен  термофильный актиномицет Micromonospora vulgaris штамм РА-П4, образующий комплекс литических ферментов. Эти ферменты разрушают клеточные стенки различных бактерий и дрожжей (мертвых и живых). Литические ферменты могут найти применение в различных областях народного хозяйства: в повышении усвояемости и питательной ценности кормовой микробной биомассы, в борьбе с бактериальными инфекциями человека и животных и в других областях.

Термофильные бактерии издавна  применяются для очистки сточных  вод. Интерес к метановому брожению резко возрос, когда была обнаружена способность бактерий продуцировать витамин В12. В. Н. Букин показал возможность получения этого ценного витамина при сбраживании термофильными метановыми бактериями ацетоно-бутиловой барды. Одновременно может быть собран выделяющийся при этом метан (10—20 м3 на 1 м3 сброженной жидкости).

Термофильные микроорганизмы играют существенную роль в круговороте  веществ в природе: в разрушении нефтей и озокеритов, превращениях серы и других процессах.

В ряде промышленных производств  термофильные бактерии могут приносить  и существенный вред: вызывают заражение  сусла на пивоваренных заводах, порчу  консервов (особенно анаэробные бактерии), сгущенного стерилизованного молока, сахарных сиропов. Поэтому необходимы надежные методы стерилизации.

Как для культивирования  полезных форм термофильных бактерий, так и для методов борьбы с  вредными для определенных процессов  видами необходимо вести глубокое изучение морфологических, физиологических  и биохимических особенностей этих микроорганизмов.

 

1.2 Состояние вопроса 

 

Микробная металлоредукция  – это способность микроорганизмов  восстанавливать структуру металлов в процессе метаболизма.

Участие микроорганизмов в процессах  восстановления соединений железа известно с конца XIX начала XX веков (Рунов 1926). Долгое время считалось, что основной причиной понижения степени окисления Fe(III) является изменение физико-химических параметров среды за счёт жизнедеятельности микроорганизмов. Существование энзиматических механизмов восстановления Fe(III) было продемонстрировано в 40-70 годы XX века. Объектом этих исследований, в основном, были бактерии с бродильным типом метаболизма, для которых наличие трёхвалентного железа не являлось необходимым условием роста (Roberts 1947, Bromfield 1954, Ottow 1968). Способность микроорганизмов к облигатной железоредукции («железному дыханию») была впервые показана Балашовой и Заварзиным в 1979 г. В этих экспериментах бактерия, идентифицированная как Pseudomonas sp., восстанавливала гидроксид железа и ферригидрит молекулярным водородом. В конце 80-х годов появились работы Лавли и др. (Lovley et al. 1987, Lovley & Phillips 1988) и Майерса и Нильсона (Myers & Nealson 1988), демонстрировавшие использование Fe(III) и Mn(IV) в качестве конечного акцептора электронов при росте микроорганизмов на несбраживаемых органических соединениях. Бактерии, выделенные в результате этих исследований и отнесённые к родам Geobacter и Shewanella, стали в дальнейшем модельными объектами для изучения биохимических и физиологических аспектов микробной металлоредукции. В случае с Geobacter интерес к исследованиям подогревался ещё и тем, что этот организм преобразовывал слабокристаллический оксид железа во внеклеточный магнетит. До этого считалось, что формировать магнитные минералы, в виде относительно небольших по массе внутриклеточных включений, способны лишь магнетотактические бактерии (Blakemore 1975). Открытие способности микроорганизмов к образованию значительных количеств магнетита в результате диссимиляционного процесса в анаэробных условиях заставило по-новому взглянуть на проблемы, связанные с генезисом древних железистых кварцитов и магнетизацией современных почв. Перед исследователями сразу встал вопрос, насколько широко может быть распространено диссимиляционное восстановление Fe(III) в различных физико-химических условиях. Верхняя температурная граница микробной железоредукции была особенно интересна в связи с выдвинутой гипотезой о том, что в микробных сообществах Архея и Протерозоя, вероятно, состоявших в значительной степени из термофильных микрорганизмов и формировавших основу древнейшей биосферы; восстановление трёхвалентного железа могло быть первым глобально значимым механизмом окисления органического вещества (Walker 1987).