Определение афлатоксинов, в частности М1, в молочных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

       Рис. 4. Схема флуориметрического детектора

       1 – лампа; 2 – оптическая система; 3 – дифракционная решётка; 4 –  щель монохроматографа; 5 – кювета; 6 – хроматографическая колонка; 7 – сферическое зеркало; 8 – светофильтр; 9 – фотоэлектрический умножитель; 10 – заглушка.

       Фотоэлектронный умножитель – это часть регистрирующей системы, которая, кроме него, содержит также самописец и интегратор, позволяющий рассчитывать относительные площади получаемых пиков. Замыкает схему работы жидкостного хроматографа блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером, который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором. В данном случае это двухканальная русская версия программы сбора и обработки данных Мультихром.  

3. Экспериментальная часть 

3.1. Методика по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксина М1 в молочных продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии 
 

       В основе используемых методических указаний лежит метод определения афлатоксинов по изменению интенсивности их флуоресценции при высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Качественное подтверждение  наличия афлатоксинов осуществляется по форме пика и его расположению. Предел обнаружения метода для афлатоксина М1 – 0,02 мкг/л при использовании флуоресцентного детектора. Относительное стандартное отклонение метода составляет 0,05-0,1. Степень извлечения афлатоксина М1 72-76%. Продолжительность анализа 2-2,5 часа. [16]

       Метод включает следующие стадии:

       - приготовление стандартного рабочего  раствора афлатоксина М1;

       - экстракцию афлатоксинов из образца; 

       - очистку экстрактов от белков, липидов, пигментов; 

       - разделение, идентификацию и определение  содержания афлатоксинов с помощью  нормально-фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным  детектором.[16]

       Приготовление стандартного раствора афлатоксина М1 предшествует всем последующим операциям определения афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах. Навеску кристаллического афлатоксина М1 в 25 мг помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация афлатоксина М1 в приготовленном стандартном растворе составляет 25 мкг/л. Для приготовления стандартного рабочего раствора афлатоксина М1 с максимально допустимой концентрацией согласно нормативным документам 0,5 мкг/л в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного раствора афлатоксина М1 и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). [16]

       Следующей операцией является экстракция афлатоксинов из исследуемого продукта.

       В коническую колбу на 250 мл помещают 66 мл натурального молока, 10 мл водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты, 120 мл хлороформа. Все составные части предварительно подогревают до температуры 35-38ºС. Содержимое колбы встряхивают 2-3 минуты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при 3000-40000 об/мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, замеряют объем фильтрата (V₂) и упаривают до 5 мл.

       Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5мм), заливают 2 мл суспензии силикагеля в гексане и сверху насыпают  слой безводного сульфата натрия. Дают гексану стечь так, чтобы над слоем сульфата натрия осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта. Дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают 25 мл смесями толуол-уксусная кислота (9,5:0,5), 25 мл гексана и 25 мл смеси эфир-гексан-ацетонитрил (5:3:1). Афлатоксин М1 элюируют с колонки 60 мл смеси хлороформацетон (4:1). Элюат упаривают досуха, растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью ВЭЖХ. [16]

       Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода (90:8:2), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин. Чувствительность детектора устанавливается  таким образом, чтобы 0,6-0,8 мг афлатоксина М1 соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1, 2, 3 мкл рабочего раствора афлатоксина М1, что соответствует 0,2, 0,4, 0,6 мг афлатоксина М1. Для каждого количества афлатоксинов измеряют высоту пика. В приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина М1 8-9 минут.

       В инжектор хроматографа вводится с помощью  микрошприца 20 мкл раствора очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени с афлатоксином М1, определяют его высоту (h). Расчет концентрации афлатоксина М1 проводят по формуле (1):

                  V₁ x V₃ x h x m_ст

          С = ------------------------

                 V₂ x V₄ x h_ст x M

       С   - концентрация афлатоксина М1 в молоке, мкг/л;

       V₁  - объем хлороформа, взятого для экстракции (0,12 л);

       V₂  - объем хлороформного экстракта, взятого для анализа (0,0909 л);

       V₃  - объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ (0,0002 л);

       V₄  - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора хроматографа (2 мл);

       m_ст.- количество мкг афлатоксина М1 в введенном объеме стандарта;

       h_ст. - высота пика стандарта афлатоксина в мм;

       h    - высота пика афлатоксина в  введенном объеме экстракта в  мм;

       М   - навеска продукта, взятая в г.

       Если  пик афлатоксина М1 в образце  выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в инжектор раствора экстракта (V₄) или разбавляя раствор экстракта хлороформом, т.е. увеличивая объем V₃.

       Методические  указания предназначены для использования  лабораториями институтов гигиенического профиля и базовых санэпидстанций, осуществляющих контроль за импортируемой  продукцией, а также  при изучении частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов и продовольственного сырья афлатоксинами. Данные методические указания могут использоваться наряду с действующими  в настоящее время “Методическими рекомендациями по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье” №2273-80, отличаясь от последних более высокой чувствительностью и воспроизводимостью методов анализа, а также сокращенным временем проведения анализа.  
 
 
 

3.2. Анализ экспериментальных данных 
 
 

       Для проведения анализа по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксина М1 в молоке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии было выбрано две торговых марки молока:  Молоко Селянське питне суперпастеризоване и Молоко Злагода питне.

       Молоко  Селянське^® питне суперпастеризоване, жирність 3,2 %

Склад продукту: молоко коров”яче

Поживна (харчова) цінність на 100 г продукту: жири – 3,2 г, білки – 2,8 г, вуглеводи  –4,7 г.

Калорійність (енергетична цінність) на 100 г продукту – 58 ккал

Строк придатності та умови зберігання: не більше 45 діб при температурі від 1ºС  до 25ºС та не більше 30 діб при нерегульованій температурі.

ТУ У 15.5-23063575-004-2003

Упаковка - асептик тетрапак;

Кількість нетто: 900 г

Виробник, адреса потужностей виробництва: ТОВ  «Люстдорф», Україна, 22700, Вінницька обл., м.Іллінці, вул.Коцюбинського, 1, тел./факс: (04345) 2-10-94; 2-11-94, www.loostdorf.com

Дата  упакування: 29.12.09, 00:13

Дата, до якої бажано спожити продукт: 12.02.10

Без ГМО

Сертификати якості: Укрсепро 022, SM 1003.

Данный  образец молока далее будет именоваться  образец № 1.

       Молоко  Злагода^® питне, жирність 2,5 %

Склад продукту: молоко коров”яче нормализоване

Поживна (харчова) цінність на 100 г продукту: жири – 2,5 г, білки – 2,82 г, вуглеводи  – 4,73 г; вітаміни А – 0,02 мг; В₂ – 0,15 мг; С – 1,3 мг.

Калорійність (енергетична цінність) на 100 г продукту – 53 ккал

Строк придатності – не більше 7 діб

Умови зберігання - при температурі від 2ºС  до 6ºС.

Упаковка  поліетиленова

Маса  нетто: 1000 г

Виробник, адреса потужностей виробництва: ВАТ АК «Комбінат Придніпровський», Україна, 49051, вул. Журналістів, 15.

Вжити до: 04.01.10

Сертификати якості: система ISO 9001:2000

Данный  образец молока далее будет именоваться  образец № 2.

       Выполняем процедуру анализа согласно Методике по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксина М1 в молочных продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сначала проводим хроматографический анализ для стандартного рабочего раствора афлатоксина М1.

       Условия:  Колонка: Synergi Polar-RP; 250*4,6 мм; 4 мкм

Защитная  колонка: SecurityGuard Polar-RP; 4*3,0 мм

Режим разделения: Изократический

Подвижная фаза: ацетонитрил/вода (2:3)

Расход: 0,8 мл/мин

Температура колонки: 20°С

Объем пробы: 2 мл

Детектор: Флуориметрический

Параметры детектирования: RFU 0,005, Ex-365 нм, Em- 400-460нм

Объект  исследования: Стандартные смеси

Группы  веществ: Микотоксины

       

Рис. 5. Хроматограмма стандартного рабочего раствора афлатоксина М1 

       С помощью данной хроматограммы определяем, что высота пика стандарта афлатоксина  составляет 100 мм; форма пика отклоняется от гауссовой, так как имеет более острую вершину; время удерживания стандарта афлатоксина – 9 минут 25 секунд.

       Выполняем хроматографический анализ для образца  № 1.

       Условия: Колонка: Synergi Polar-RP 250х4.6 мм 4 мкм

Защитная  колонка: SecurityGuard Polar-RP 4х3.0 мм

Режим разделения: Изократический

Подвижная фаза: ацетонитрил/вода (2:3)

Расход: 0.8 мл/мин

Температура колонки: 20°С

Объем пробы: 2 мл

Детектор: Флуориметрический

Параметры детектирования: RFU 0.005, Ex-365 нм, Em- 400-460нм

Объект  исследования: Молочная и маслосыродельная продукция

Группы  веществ: Микотоксины

Образец: проба молока с предположительным  содержанием афлатоксина М1.

          Рис. 6. Хроматограмма молока Селянского 

       В соответсвии формуле 1 из приведённой  выше методики , выполняем расчёты концентрации афлатоксина М1 в образце № 1:

0,12 * 0,0002 * 4,2 * 250 / 0,0909 * 0,002 * 66 * 70 = 0,03 (мкг/л).

Так как  предельно допустимая концентрация афлатоксина М1 согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 составляет 0,5 мкг/л, то образец № 1 с концентрацией афлатоксина М1 0,03 мкг/л пригоден для употребления.

         Выполняем хроматографический анализ для образца № 2. Хроматографические условия такие же, как и при анализе образца № 1.

         Рис. 7. Хроматограмма молока Злагода