Оптимизация условий культивирования бактерии xanthomonas campestris и выведеления ксантана из культуральной жидкости

     Перспективными  продуцентами гетерополисахарида ксантана являются штаммы вида X. campestris [13,31]. По внешнему виду это прямые, преимущественно одиночные палочки (0,4-1,8 мкм), грамотрицательные, неспороносные, подвижны за счёт одного полярного жгутика (рисунок 1.1). Подвижность их прогрессивно снижается по мере обволакивания клеток синтезируемым ими полисахаридом.  

     

 

     Рисунок 1.1 –Бактерии X. campestris 

     Одним из наиболее известных микробных  ЭПС, используемых в технических целях, является ксантан (продуцент – X. campestris), обладающий  уникальными  реологическими свойствами, благодаря которым применение, а, следовательно, и его производство постоянно расширяется. Следует отметить, что он может синтезироваться при глубинной ферментации и накапливаться в значительных количествах в культуральной жидкости [8], что предопределяет возможность промышленного использования. Существенной проблемой, возникающей при промышленном синтезе ксантана, является повышенная требовательность продуцента к составу питательных сред, что влияет на стоимость продукта. В связи с этим подбор оптимальных сочетаний различных компонентов питательной среды для культивирования с целью получения ксантана является важным условием для получения максимальных количеств этого биополимера.

     Для выращивания X. campestris с целью получения ксантана необходима питательная среда, содержащая как микроэлементы (K, Fe, соли Ca), так и микроэлементы (источники углерода и азота). Наиболее часто в качестве источника углерода используют глюкозу и сахарозу. Причем, их концентрация влияет на выход ксантана и наибольший выход имеет место при 2–4%. Образование ксантана культурой X. campestris наблюдается так же не только на этих субстратах, но и при выращивании продуцента на среде с мальтозой, фруктозой, лактозой. Увеличение выхода ксантана было достигнуто при добавлении к среде, которое содержит глюкозу или сахарозу, пирувата (0,3%), сукцината (0,6%) [32]. Так же было отмечено, что высокие концентрации органических кислот подавляли синтез ксантана.

     Источником  азота могут служить как органические, так и неорганические соединения. Однако введение в среду культивирования X. campestris мелассы позволяет не вносить дополнительно органический источник азота [13].

     Отношение C/N в среде, обычно используемой для получения ксантана, ниже чем, таковое, используемое для роста культуры. Благоприятным является соотношение C/ N = 14 - 20 [13]. Как правило, низкие концентрации, как азота, так и углерода способствуют образованию ксантана. В случае лимитирования культуры по углероду и фосфору образование ксантана также улучшается. При лимитировании углеродом бактерии X. campestris синтезировали ЭПС с той же скоростью, как и в условиях лиметирования другими субстратами [20].

     Лучшими источниками углерода являются глюкоза  и сахароза, а источниками азота  – глутамат в концентрации 15 мМ, а более высокие его концентрации ингибируют рост. Низкие концентрации органических кислот (например, янтарной и лимонной) при добавлении в среду усиливают образование ксантана. В литературе отмечается их стимулирующее действие (пирувата, цитрата, сукцината, а-кетоглутарата) на образование ксантана [32]. Считается, что действие органических кислот связано с установлением благоприятного для синтеза ксантана значение рН. Аналогичный эффект имеет место при введении в среды культивирования X. campestris фумаровой кислоты. В этом случае наблюдается увеличение выхода ксантана с 6,0 до 9,1 г / л [13].

     Показано  также, что азот, фосфор и магний влияют на рост, тогда как на образование ксантана они не оказывают действие. Добавление ионов железа (III) к периодической культуры X. campestris сопровождалось повышением уровня биомассы и снижением синтеза ксантана. Выход ксантана так же значительно рос в присутствии цинка и магния [33].

     Бактерии, относящиеся к роду Xanthomonas, являются аэробами. Образование экзополисахарида также происходит в аэробных условиях. Следует учитывать, что ограничение подачи кислорода в процессе ферментации благоприятно влияет на накопление ксантана. Необходимая концентрация кислорода обеспечивается прямой подачей воздуха. Для равномерного распределения воздуха в среде ее интенсивно перемешивают. Если учесть, что сначала бактерии в основном размножаются, а образование экзополисахарида происходит преимущественно во второй стадии, то разная потребность в воздухе на этих стадиях свидетельствует о том, что для размножения бактерий и для образования ксантана требуется одинаковое количество воздуха. Так, высокий уровень аэрации необходим в экспоненциальной фазе роста клеток и нежелателен в начальной стационарной фазе роста – фазе образования ксантана. На этой стадии резко возрастает вязкость среды, что затрудняет доступ кислорода к клеткам и отток метаболитов, а это замедляет размножение клеток. При культивировании бактерий X. campestris подбирают определённые режимы перемешивания бактериальной массы и подачи воздуха. Исследование синтеза ксантана при культивировании продуцента в ферментере показало, что максимальный выход ЭПС наблюдался при скорости перемешивания 150 об/мин в первые 48 ч и 280 об / мин в течение остального времени, необходимого для достижения наивысшей вязкости [34]. Установлено, что оптимальная аэрация составляет 0,5 л /л среды за 1 мин, а скорость потребления кислорода варьирует от 0,4 ммоль O₂ / л в 1 мин при скорости перемешивания 150 об/мин до 1,5 ммоль O₂ / л в 1 мин при 280 об / мин. При быстром увеличении вязкости культуральной жидкости лимитирование переноса кислорода наблюдается уже через 20 часов от начала культивирования. Одновременно изменяется и рН. Концентрация ксантана продолжает повышаться, хотя лимитирование переноса кислорода увеличивается из-за повышения вязкости и, таким образом, переносимое количество кислорода постоянно уменьшается. Появляются не продуваемые зоны, вследствие чего скорость образования ксантана уменьшается.

     При изучении значения различных кинематических уровней ферментации в процессе получения ксантана была установлена  важная роль рН культуральной жидкости. По имеющимся данным оптимум рН для роста X. campestris находится в нейтральной области. Наиболее высокий выход ксантана получен при рН 7,2. Из-за кислотных групп, присутствующих в ксантане, при его образовании имеет снижение рН от нейтрального до значения, близкого к 5. Выход экзополисахарида снижается более резко при повышении концентрации водородных ионов, чем при её снижении. Если в начале ферментации среда более щелочная, то рН удерживается на оптимальном уровне более длительное время, и наоборот, если в этот период культуральная жидкость имеет слабокислую реакцию, снижение значения рН происходит более быстро. Щелочная среда (рН 7,5–8,5) не влияет существенно на ростовые показатели культуры, кинетику накопления ксантана, не снижает его качество, прежде всего вязкостные характеристики. Максимальное накопление высоковязких экзополисахаридов отмечено при нейтральном рН среды или близких к нему значениях.

     Условия культивирования, используемые культуральные среды, при которых происходит синтез экзополисахарида бактериями рода Xanthomonas, благоприятны для развития посторонней микрофлоры. В связи с этим ферментационный процесс ведут в строго стерильном режиме. Кроме того, исключение загрязнений может быть достигнуто подбором температур, оптимальных для роста культуры и синтеза экзополисахарида и губительных для других микроорганизмов. Для роста и жизнеспособности Х.campestris оптимальной является температура, находящаяся в области 25–34˚С, но культура вполне растёт при 28˚С и 30˚С. Установлено, что оптимальные значения температуры для роста культуры равны 25˚С, а 30˚С для образования ксантана. Следовательно, оптимальные температуры процесса зависят от конечной цели. Для высокого выхода ксантана можно рекомендовать температуру 31˚С и 33˚С.

     В различных условиях выращивания продуцента может изменяться химический состав ЭПС, их молекулярная масса, а также соотношение нескольких полисахаридов, что влияет на реологические свойства растворов ЭПС, определяющие практическую значимость этих полимеров [35].

     Таким образом, образование ксантана (количество синтезированного полисахарида, скорость его синтеза и выход) обусловлено составом питательной среды (природа источника углерода, азота, фосфора, их концентрация, соотношение углерод/азот, ионы металлов), способом подачи субстрата, физико-химическими факторами (температура, рН, уровень аэрации), продолжительностью процесса периодического культивирования. 
 
 
 

     2 Материалы и методы исследования 

2.1 Объект исследования 

      В качестве объекта исследования использовали штамм бактерии             X. campestris 2228.

       

     2.2 Методы исследования 

     2.2.1 Приготовление питательных  сред 

     Для культивирования бактерий на твердой  питательной среде использовали среду с сахарозой следующего состава, г/л: 

     Сахароза                              20,0

     Дрожжевой экстракт            5,0

     Пептон                                  10,0

     Агар-агар                             15,0-20,0

     режим стерилизации – 121 ⁰С (1 атм.) в течение 30 минут. 

     Для исследования роста бактерий на жидких питательных средах использовали среду с сахарозой следующего состава, г/л:

     Сахароза                             20,0

     Дрожжевой экстракт         5,0

     Пептон                                10,0

     режим стерилизации – 121 ⁰С (1 атм.) в течение 30 минут. 
 
 
 
 

     2.2.2 Условия культивирования  Xanthomonas campestris 2228 

     Бактерии  X. campestris 2228 выращивали на плотных агазированных средах в чашках Петри в термостате при температуре 28+1 ⁰С.

     Инокулят  получали путем культивирования X. campestris 2228 в конической колбе на 500 мл, содержащих 100 мл среды жидкой среды. Исходным посевным материалом являлась культура, выращенная на агаризованной среде чашки Петри. Инокулят выращивали на качалке при 250 об/мин при температуре 28+1^оС в течение двух суток. Опытные колбы засевали 5 % инокулята. Выращивание производили на качалке при 250 об/мин и при температуре 28+1^оС. Пробы стерильно отбирали по истечению указанного промежутка времени. 

     2.2.3 Определение количества ксантана и биомассы 

     Количество  ксантана в культуральной жидкости определяли весовым методом после отделения клеток центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут и осаждения экзополисахарида этанолом. При необходимости перед центрифугированием культуральную жидкость разбавляли дистиллированной водой для того, чтобы обеспечить полное осаждение биомассы при выбранном режиме центрифугирования. Этот метод широко применяют для оценки количества ксантана в жидких питательных средах.

     Определение состоит из следующих операций: доведения массы фильтров до постоянного значения, осаждения ксантана из супернатанта этиловым спиртом, определения количества ксантана в супернатанте.

     С целью доведения фильтров до постоянной массы, их помещали в открытой чашке  Петри в сушильный шкаф и высушивали до постоянной массы в течение 1 – 2 часов при температуре 105 ⁰С. Затем чашку Петри с фильтрами вынимали из сушильного шкафа и переносили в эксикатор (чашку Петри предварительно закрывали). Эксикатор ставили около аналитических весов, на которых проводилось взвешивание. Через час фильтры взвешивали с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяли. Соблюдая указанную последовательность операций, пока масса не достигала постоянного значения, то есть колебания в ее значениях не превышала ±0,0001 г.

     К одному объему супернатанта добавляли 2,5 объема 96%-ного этилового спирта, перемешивали встряхиванием и оставляли на одни сутки. Образовавшийся сгусток ксантана количественно переносили в предварительно высушенный и взвешенный бумажный фильтр, помещенный в чистую сухую воронку. Остатки ксантана на стенках посуды смывали 96%-ным этиловым спиртом. Фильтр оставляли в воронке для фильтрования суспензии до подсыхания осадка экзополисахарида на одни сутки. Затем фильтр с осадком помещали в сушильный шкаф, высушивали при температуре 105⁰С до постоянной массы и взвешивали. Количество ксантана определяли по формуле: 

     П=((А-В)/V)* 1000, 

где П  – масса сухого ксантана, г/л;

А –  масса фильтра с осадком, г;

В –  масса фильтра без осадка, г;

V – объём, взятый для анализа, мл.

     Помимо  количества ксантана на каждом этапе  отслеживался процесс накопления биомассы, путем измерения её оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 590 нм. 

      2.2.4 Статистическая обработка  результатов 

      Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере, при помощи программы FSTAT. 
 

     3 Результаты и их обсуждение 

     3.1 Определение накопления ксантана в ходе роста Xanthomonas campestris 2228 на жидкой среде