ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра биотехнологии 
 
 
 

КУРСОВАЯ  РАБОТА

 

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ  БАКТЕРИИ XANTHOMONAS CAMPESTRIS И ВЫДЕЛЕНИЯ КСАНТАНА ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ 

Автор курсовой работы                                    10.06.2011                Е.Н. Коверова

Обозначение курсовой работы                                    КР-03 069964-240901-44-11

Специальность              240901                                                          Биотехнология

Руководитель  работы

к.б.н., доцент                                                      10.06.2011                Н.А. Пестов 
 
 
 
 
 
 
 

Саранск

2011

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра биотехнологии 
 
 
 

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ 
 

Студент Е.Н. Коверова

1 Тема  Оптимизация условий культивирования бактерии Xanthomonas campestris 2228 и выделения ксантана из культуральной жидкости

2 Срок предоставления  работы к защите: ___________________

3 Исходные данные  для курсовой работы литературные данные

4 Содержание  курсовой работы

    4.1 Введение

    4.2 Аналитический обзор

    4.3 Материалы и методы исследования

    4.4 Результаты и их обсуждение

    4.5 Выводы

    4.6 Список использованных источников 
 

Руководитель  работы                                             25.03.2011         Н.А. Пестов

Задание принял к исполнению                              25.03.2011          Е.Н. Коверова

Реферат 

      Работа содержит 35 страниц, 3 рисунка, 2 таблицы, 35 использованных литературных источника.

КСАНТАН, ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ, XANTHOMONAS CAMPESTRIS

      Объектом  исследования являлись культуральная жидкость бактерии Xanthomonas campestris 2228, и ксантан выделенный из нее.

     Цель  работы – изучение влияния аэрации на биосинтез ксантана бактериями Xanthomonas campestris 2228 и оптимизации условий выделения ксантана из культуральной жидкости.

     Степень внедрения – частичная.

     Область применения – результаты могут быть рекомендованы для организации промышленного производства ксантана.

     Эффективность – производство микробных полисахаридов в настоящее время является весьма актуальным. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Содержание 
 

      Введение 

     В течение последних 20-30 лет микробные экзополисахариды (ЭПС) являются объектом интенсивных теоретических и прикладных исследований. Способность растворов микробных ЭПС к гелеобразованию, эмульгированию, суспендированию, изменению реологических характеристик водных систем обусловила широкое использование этих биополимеров в нефтяной, горнодобывающей, текстильной, пищевой, фармацевтической и химической промышленности, сельском хозяйстве и медицине.

     Экономическая выгода использования микробных  ЭПС определяется их внеклеточной природой и высокой продуктивностью синтеза на дешевых субстратах. На смену химическим полимерам (полиакриламидам) пришли микробные ЭПС, которые устойчивы к температурной, окислительной, механической деструкции, но поддаются биологической деградации и являются нетоксичными, что делает экологически безопасным их применение, например, в нефтедобыче.

     Спрос на микробные ЭПС на мировом рынке остается высоким, о чем свидетельствует, как увеличение из года в год объемов производства первого микробного ЭПС ксантана (продуцент Xanthomonas campestris), так и появление новых микробных ЭПС, например, склероглюкан (продуцента Sclerotium rolfsii, Sclerotium sp), и эмульсан (продуцент Acinetobacter calcoaceticus).

     Способность к синтезу ЭПС обнаружено у многих микроорганизмов, однако уровень синтеза этих полимеров колеблется в широких пределах как для различных продуцентов ЭПС, так и для одного продуцента в различных условиях его культивирования.

     Уровень биосинтеза вторичных метаболитов, к которым относится ЭПС, в значительной степени зависит от внешних факторов. Поэтому при разработке технологии получения микробных ЭПС важным и необходимым этапом является подбор оптимальных комбинаций различных параметров культивирования продуцентов.

     В связи с этим целью данной работы являлось изучение влияние аэрации  на биосинтез ксантана бактериями X. campestris и оптимизация условий выделения ксантана из культуральной жидкости.

     Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить время, при котором выход ксантана будет максимальным.
2. Определить соотношение объем среды : объем колбы, при котором выход ксантана будет максимальным.
3. Определить влияние присутствия NaCl на осаждение ксантана из культуральной жидкости.

      1 Аналитический обзор 

     1.1 Характеристика бактериальных полисахаридов 

     Полисахариды (гликаны) – полимеры, построенные  не менее чем из 11 моносахаридных единиц. Их молекулы построены из моносахаридных остатков, соединенных гликозидными связями. Они могут состоять из одного или нескольких типов моносахаров. Соответственно различают гомополисахариды и гетерополисахариды. Каждый моносахаридный остаток в составе полисахаридов может находиться в пиранозной или фуранозной форме. Он способен образовывать одну гликозидную связь с соседним моносахаридом, но может предоставить несколько гидроксильных групп для присоединения других моносахаридов. В соответствии с этим, молекулы полисахаридов могут быть линейными или разветвленными [1]. Полисахариды являются обязательным компонентом всех организмов, присутствуют как изолированно, так и в комплексах с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами. Полисахариды преобладают в растительных биомассах и составляют, следовательно, большую часть органического материала на планете. Полисахариды разнообразны по строению, локализации в клетках и, естественно, по своим физико-химическим свойствам. Особым разнообразием отличаются полисахариды микроорганизмов. Некоторые из них близки или идентичны полисахаридам растений и животных. Но подавляющее большинство бактериальных полисахаридов имеет уникальную структуру, специфическую для вида [2]. Микробные ЭПС имеют ряд преимуществ по сравнению с полисахаридами растительного происхождения. Эти биополимеры можно получать в нужных объемах независимо от времени года и климатических условий. Экономическая выгода использования микробных ЭПС определяется их внеклеточной природой и высокой продуктивностью синтеза на дешевых субстратах [3]. В бактериальных гликанах часто обнаруживают ранее неизвестные моносахара, которые не встречаются ни у животных, ни у растений [2]. О том, что слизь, образуемая многими микроорганизмами, может иметь углеводную природу, знали еще во времена Пастера. Однако особое внимание микробным полисахаридам стали уделять лишь с начала 20-х годов нашего столетия, когда узнали, что вещества, определяющие серологическую специфичность пневмококков, являются полисахаридами [4]. В настоящее время исследование бактериальных полисахаридов приобрело особое значение в связи с открывшейся возможностью широкого применения их в медицине и ряде областей народного хозяйства. Благодаря своим качествам – высокие вязкостные и гелеобразующие свойства, сочетаемость с рядом солей в широких пределах pH и температуры, хорошая растворимость в воде и синергизм с некоторыми полисахаридами, они находят применение в самых разных сферах человеческой деятельности: в медицине, фармацевтической, пищевой, химической и текстильной промышленности, в гидрометаллургии, при добычи нефти и ряде других областей народного хозяйства [5].

     Полисахариды  микроорганизмов в соответствии с локализацией делятся на внутриклеточные (эндогликаны) и внеклеточные (экзогликаны). К внутриклеточным относят обычно полисахариды цитоплазмы, мембран и клеточных стенок, а к внеклеточным — полисахариды капсул, чехлов (пристеночные структуры) и свободной слизи, не прилегающей к клеточной стенке. Иногда к внеклеточным относят также полисахариды, локализованные снаружи от цитоплазматической мембраны. В этом случае в группу внеклеточных попадают и полисахариды клеточных стенок. У микроорганизмов действительно трудно различить границу между капсулой и клеточной стенкой. Нередко, по локализации выделяют три группы полисахаридов: внутриклеточные (цитоплазмы, мембран, периплазмы), полисахариды клеточных стенок и внеклеточные (капсул, чехлов и свободной слизи). Термин «экзогликаны» применяют в основном к полисахаридам свободной слизи [6]. Синтез ЭПС идет более активно, и они легче отделяются от биомассы и очищаются от примесей. Внеклеточные полисахариды микроорганизмов очень разнообразны по строению и составу [7].

     Согласно  классификации микробные ЭПС делят на пять групп [8]. Первая группа включает декстраны и родственные полисахариды (леван). Они состоят из моносахаридов одного типа, то есть гомополисахариды. Синтез этих ЭПС осуществляется на средах содержащих сахарозу как специфический субстрат. При отсутствии такого специфического субстрата (кроме сахарозы, это могут быть другие родственные углеводы) образование ЭПС не отмечается. Продуцентами ЭПС первой группы являются представители родов Streptococcus и Leuconostoc.

     Для образования ЭПС второй группы также необходимо наличие специфического углеродного субстрата, однако синтезированные ЭПС является гетерополисахаридами. На сегодняшний день выявлено образование такого ЭПС псевдомонадами.

     К третьей группе относят гомополисахариды, которые синтезируются на разных углеродных субстратах. Некоторые из этих гомополисахаридов состоят исключительно из углеводов, в частности, бактериальная целлюлоза, пулулан (продуцент Aureobasidium pullulans), курдлан (продуценты Alcaligenes faecalis и Agrobacterium radiobacter), склероглюкан (продуценты Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Sclerotium sp), другие содержат ацетильные группы (например, ЭПС, синтезированные определенными видами Agrobacterium).

     Четвертая группа микробных ЭПС является самой многочисленной. Ее представителями являются гетерополисахариды, которые состоят из структур с повторяющимися блоками. К этой группе относят самый сложный ЭПС - ксантан, а также промышленно ценные ЭПС – гелан и эмульсан.

     К пятой группе микробных ЭПС относится бактериальный альгинат. Этот гетерополисахарид состоит из мономеров двух типов: D-маннуроновой и L-гулуроновой кислот. В отличие от ЭПС четвертой группы в альгинате нет повторяющихся единиц. Продуцентами альгината является Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii. Бактериальный альгинат отличается от альгината из морских водорослей наличием О-ацетильного групп, присоединенных к D-маннуроновой кислоте. Микробные альгинаты используют в пищевой промышленности как заменители альгинатов из водорослей.

     Использование микроорганизмов для получения промышленно-ценных полисахаридов можно сделать более эффективным с помощью следующих усовершенствований:

1) увеличения  скорости образования полисахаридов  и повышения их выхода;

2) модификации  получаемых полисахаридов;

3) изменения  поверхностных свойств микроорганизмов-продуцентов  для облегчения отделения клеток на последующих этапах переработки;

4) устранения  ферментативных активностей, способных  вызвать нежелательные модификации  полисахаридов;

5) переноса  генетических детерминант синтеза  полисахаридов в технологически  более удобные организмы-продуценты. Именно этими проблемами в настоящее время занимаются учёные во всём мире [9].

     Большинство микробных синтетиков ЭПС используют углеводы как источник углерода и энергии. При промышленном производстве ЭПС как субстраты обычно используют продукты, полученные из сахарной свеклы: мелассу, сахарный сироп, сахарозу, либо из кукурузы: крахмал, гидролизованный крахмал, глюкозный сироп, глюкозу [10]. Однако исследования, проведенные в течение 70-80-х годов, продемонстрировали возможность расширение сырьевой базы микробиологического производства ЭПС за счет использования непищевых субстратов (метан, метанол, этанол, этиленгликоль, углеводороды).

     Как источник азота при получении микробных полисахаридов обычно используют минеральные (аммонийные соли, нитраты) и органические (дрожжевой и кукурузный экстракты, пептон, мочевина) компоненты. В некоторых случаях органический азот, а также сочетание органического и минерального азота содействует на  повышенный синтез ЭПС. Лимитирование роста продуцентов ЭПС азотным источником питания в условиях избытка углерода позволяет направить биосинтетические процессы в сторону синтеза ЭПС.