Оптимизация условий культивирования бактерии xanthomonas campestris и выведеления ксантана из культуральной жидкости

     Для оптимального синтеза ЭПС существенное значение имеет соотношение углерода и азота (C / N) в среде культивирования продуцента [11, 12, 13, 14, 15]. Изучение влияния концентрации источники азота (нитрата аммония) в среде культивирования бактерий на синтез ЭПС показало, что независимо от содержания этанола и глюкозы в среде, при снижении концентрации азота наблюдалось существенное повышение выхода ЭПС по отношению к биомассе и субстрату [13].

     Для микроорганизмов, которые утилизируют источник углерода, способные подавлять рост клеток, большое значение имеет способ подачи субстрата. Введением дополнительного количества источника углерода в конце экспоненциальной фазы роста бактерий позволяет увеличить концентрацию ЭПС в культуральной среде, улучшить физико-химические свойства и сократить продолжительность ферментации [15].

     В качестве источников фосфора обычно используют одно- и двухосновные фосфаты калия и натрия [11]. Известно, что ионы металлов необходимы для роста микроорганизмов и синтеза ими ЭПС, однако вопрос их влияния на синтез ЭПС изучен недостаточно [8].

     В основном температура и рН среды, оптимальные для роста продуцента, являются оптимальными и для синтеза ЭПС. Однако в некоторых случаях снижение или повышение температуры культивирования продуцентов относительно оптимальной для их роста приводит к увеличению концентрации синтезированных ЭПС. Поддержание значения рН среды на постоянном уровне в течение процесса культивирования большинства продуцентов также сопровождается повышением синтеза ЭПС.

     В ряде случаев снижение температуры ниже оптимальной сопровождается увеличением концентрации ЭПС [16, 17, 18], что можно рассматривать как проявление защитных функций ЭПС в ответ на некомфортные условия существования продуцента. Кроме того, вполне возможно, что у некоторых микроорганизмов температурный оптимум ферментов, участвующих в образовании (или полимеризации) ЭПС, отличается от оптимума ферментов, использующих для синтеза биомассы. Синтез ЭПС у микроорганизмов является более чувствительным к изменениям рН, чем синтез биомассы.

     Подавляющее большинство микроорганизмов - продуцентов ЭПС являются строгими аэробами, реже - факультативными анаэробами. Уровень дыхания бактерий влияет на интенсивность синтеза ЭПС: при более активном дыхании количество ЭПС уменьшается, поскольку больше углеродного субстрата превращается в СO₂. Потребность в растворенном кислороде строго специфична для каждого продуцента, она устанавливается экспериментально и меняется в разных фазах роста. Для некоторых культур высокий уровень аэрации является необходимым в фазе экспоненциального роста и необязателен  - в стационарной фазе [19, 20]. И, наоборот, для других продуцентов ЭПС высокий уровень аэрации необходим на протяжении всего процесса культивирования.

     У микроорганизмов-продуцентов ЭПС синтез полисахаридов может быть тесно связан с ростом, например, у Methylocystis parvus ОВВР, частично связан с ним - Xanthomonas, Methylomonas methanolica, и не связан - Alcaligenes, Rhizobium [8]. У большинства микроорганизмов достижение максимальной удельной скорости роста и синтеза ЭПС не совпадает. Как правило, максимальная скорость синтеза ЭПС наблюдается в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста. Однако концентрация ЭПС в культуральной жидкости достигает наивысшего значения в конце периодичного процесса, т.е. в стационарной фазе. В зависимости от условий культивирования продолжительность периодических процесса для различных продуцентов ЭПС составляет от 24 до 120 ч. Определение фазы роста продуцента, в которой скорость синтеза ЭПС является максимальной, а также фазы роста, где достигается максимальная концентрация ЭПС, позволит установить оптимальную продолжительность процесса при периодическом культивировании.

     Условия культивирования влияют не только на такие показатели процесса, как количество ЭПС, скорость их образования, выход ЭПС в зависимости от субстрата, но и на физико-химические свойства синтезированных ЭПС. Важной характеристикой микробных ЭПС является реологические свойства их растворов, которые в значительной степени обусловлены качественным и количественным составом полисахаридов. Различия в реологических характеристиках ЭПС, синтезированных одним продуцентом, могут быть объяснены его способностью синтезировать несколько, различных по физико-химическим свойствам, полимеров, а также изменением количества боковых заместителей в составе ЭПС в зависимости от условий культивирования [11, 21, 22]. На физико-химические свойства микробных ЭПС в значительной степени действуют такие факторы, как продолжительность ферментации, состав среды, способ подачи субстрата, уровень аэрации.

     Таким образом, несмотря на многочисленные исследования влияния условий культивирования  на образование и свойства ЭПС, получение экспериментальных подтверждений остаются важными и первоочередными задачами при организации промышленного производства микробных ЭПС. 
 
 
 
 
 
 
 
 

     1.2 Основные бактериальные полисахариды, используемые в промышленном производстве и их применение 

     Декстраны – группа бактериальных полисахаридов, состоящих из остатков a-D-глюкопиранозы. Молекулы декстранов – разветвленные цепи, линейная часть которых содержит главным образом 1-6-связи и небольшое количество 1-3-связей (в некоторых редко встречающихся декстранах обнаружены чередующиеся 1-6- и 1-3-связи). Разветвления в молекуле декстрана образуются с помощью 1-2-, 1-3- или 1-4-связей. Боковые ветви молекулы состоят обычно из одного или двух остатков глюкозы, реже встречаются более длинные боковые цепи [23]. Свойства полисахарида зависят от его структуры и молекулярной массы. Декстран синтезируется самыми разными грамположительными и грамотрицательными бактериями, такими как Streptococcus bovis и S. viridans, а также Leuconostoc mesenteroides. В промышленности этот полимер получают выращиванием последнего из перечисленных микроорганизмов на сахарозе, с последующим осаждением декстранов органическим растворителем. Прежде всего, декстраны используют в качестве заменителей плазмы (для увеличения объема крови); кроме того, они применяются в медицине для создания гидрофильного слоя на обожженных поверхностях в целях поглощения жидких экссудатов. Для разделения и очистки биологических молекул находят широкое применение производные декстранов с поперечными сшивками, в которых функциональные группы (например, карбоксиметильные или диаминогруппы) соединены с глюкозными остатками эфирными связями. Сульфатированные декстраны используют в качестве полиэлектролитов [24].

     Альгинаты — натриевые, калиевые, кальциевые соли альгиновой кислоты. Источником альгинатов издавна служили морские водоросли, однако по природе своей этот источник непостоянен. Среди бактерий, близкие к альгинату гетерополисахариды образуют из D-маннуроновой и L-гулуроновой кислот Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii. Этот процесс осуществляют в промышленном масштабе, выращивая Azotobacter в условиях избытка углерода. Микробный альгинат отличается от соответствующего продукта из водорослей наличием О-ацетильных групп, связанных с остатками D-маннуроновой кислоты [18].

     Основным  свойством альгинатов является способность  образовывать особо прочные коллоидные растворы, отличающиеся кислотоустойчивостью. Растворы альгинатов безвкусны, почти  без цвета и запаха. Они не коагулируют  при нагревании и сохраняют свои свойства при охлаждении, при замораживании и последующей дефростации. Поэтому наиболее широко альгинаты применяются в пищевой промышленности в качестве студнеобразующих, желирующих, эмульгирующих, стабилизирующих и влагоудерживающих компонентов. Кроме пищевой промышленности альгинаты широко применяются в медицине, текстильной, целлюлозно-бумажной, горнодобывающей и других отраслях промышленности. В фармацевтической промышленности альгиновую кислоту и ее соли применяют в качестве склеивающего и разрыхляющего вещества при производстве таблеток, драже, пилюль. Благодаря способности альгинатов поглощать 200–300-кратное количество воды с образованием лишенных вкуса, цвета и запаха вязких стабильных гелей, их применяют в качестве компонентных основ для различных мазей и паст. В целлюлозно-бумажной промышленности альгинаты используются для поверхностной обработки картона и специальных сортов бумаги для перфолент, а также бумаги с пленочным покрытием. Альгинаты также используются в производстве ламинированных декоративных пленок для покрытия древесно-стружечных плит.

     Курдлан – линейный полисахарид, состоящий из D-глюкозы. Вырабатывается непатогенными бактериями Alcaligenes faecalis var myxogenes, штамм 10СЗ и выделяется путем осаждения соляной кислотой [18]. Курдлан нерастворим в холодной воде, и его гели можно получать также путем диализа щелочных растворов против воды. Водные суспензии (2-6%) курдлана при нагревании выше 55°С становятся прозрачными и при охлаждении образуют мягкие устойчивые гели. Если раствор на несколько минут нагреть до более высокой температуры (110-130°С в автоклаве), образуется прочный эластичный гель, который является существенно более стойким к циклам замораживания-оттаивания, чем гели из агара [25]. Этот полисахарид может найти применение в качестве гелеобразователя в кулинарии, он может использоваться как молекулярное сито, как подложка при иммобилизации ферментов и как связующий агент. В пищеварительном тракте курдлан не расщепляется и не всасывается. Однако ни в Европе, ни в РФ не имеет разрешения на применение в пищевых продуктах. Помимо пищевой промышленности курдлан используют в медицине; его модифицированные препараты имеют противоопухолевую активность. Сульфированный полимер обладает антивирулентной активностью. Ацетильные производные курдлана используют в качестве основы ультрафильтрационных полупроницаемых мембран для фракционирования веществ с молекулярной массой 200–2000 Да. Селективность таких мембран по фуранозе составляет 96 %, по витамину В12 — 97 % [26].

     Пуллулан  представляет собой α-D-глюкановый полисахарид, состоящий из α-1-6-мальтотриозных и небольшого числа мальтотетраозных единиц [18]. Он синтезируется Aureobacidium pullulans и образует прочные, упругие пленки и волокна, которые можно формовать. По сравнению с целлофаном и полипропиленом эти пленки малопроницаемы для кислорода. Пуллулан, возможно, найдет применение в качестве упаковочного материала или флоккулирующего агента в суспензиях глин в горной промышленности. Он устойчив к амилазам, но разрушается ферментом пуллуланазой. Было описано также образование пуллулана видами Artherobacter, Beijerinckia и бактериями, использующими метан и метанол. Из культуральной жидкости нативный пуллулан выделяют осаждением этиловым спиртом [25]. Молекулярная масса нативного пуллулана составляет несколько миллионов дальтон, поэтому его подвергают радиационно-химической деструкции, в результате которой происходит снижение молекулярной массы до 62500±12500 Да.

     Наиболее  известный микробный полисахарид  — ксантан. Это – сложный, высоко разветвленный полисахарид. Основная цепь ксантана построена аналогично целлюлозе (1-4–β-гликопираноза), а в ответвлениях основной цепи — трисахарид, состоящий из β-D-маннозы, β-D-глюкуроновой кислоты и α-D-маннозы [27]. Ксантан — внеклеточный высокомолекулярный полисахарид, являющийся продуктом особого вида брожения, получаемый в результате ферментации глюкозы или сахарозы бактерией X. campestris. Бактерии выделяют слизистое вещество на внешнюю поверхность клеточной стенки, которое защищает их от вирусов и пересыхания. Сброженную питательную среду пастеризуют для удаления микробов, осаждают спиртом, или очищают методом микрофильтрации. В итоге получают порошок белого или кремового цвета. В водных растворах – это коллоид, обладающий исключительными реологическими свойствами, к которым относятся:

• устойчивость к ферментам, ПАВам, спиртам, высококонцентрированным растворам солей; выдерживает длительное присутствие 10% лимонной кислоты, 20% и 10% уксусной; в растворе поваренной соли (5-20%) вязкость 0,5% раствора ксантана возрастает на 10%; устойчив в присутствии 30% глицерина, гликолей, этилового и изопропилового спирта;
• устойчивость к высоким и низким температурам, сохраняет структуру в диапазоне -18+120 ºС при замораживании и размораживании, в горячем состоянии имеет более высокую вязкость;
• устойчивость к воздействию давления и микробной деструкции.
• совместимость с разными, резко отличающимися по химической природе веществами. Ксантан обладает еще одним ценным свойством: он абсолютно не токсичен.

     Пищевая промышленность – главный потребитель ксантана. Биополимер применяют в пищевой промышленности главным образом в виде наполнителя [25]. Ксантан используется при производстве напитков, концентратов быстрого приготовления, замороженных продуктов, молочных продуктов (йогуртов, сливок, сыров), глазурей, мясных продуктов, диетических продуктов. Гидроколлоиды, к которым относится ксантан широко используются на предприятиях мясной промышленности с целью повышения выхода мясных изделий и снижения себестоимости готовой продукции. Как консервант пищевых продуктов ксантан используется в виде напыленных или заранее сформированных пленок для упаковки пищевых продуктов.

     Также ксантан применяется в косметической  промышленности при производстве кремов для лица и лосьонов, зубных паст и шампуней.

     В сельском хозяйстве используется для  повышения урожайности и экономии удобрений, а также как суспендирующий агент в жидких кормовых добавках для крупного рогатого скота. Ксантан  может применяться для извлечения нефти из иссякающих месторождений. Раствор ксантана в воде обладает высокой вязкостью и при закачке в пласты под повышенным давлением высвобождает капли нефти из всех трещин и углублений нефтеносных пород.

     В строительстве ксантан можно  использовать при приготовлении  жидких строительных растворов для получения гипса. За счет большого внутреннего сцепления применяется в низких концентрациях как добавка к цементирующим смесям, к замазкам для панельных швов.

     В лакокрасочной промышленности ксантан  стабилизирует и улучшает текучесть густых синтетических эмульсионных и водорастворимых красок. Благодаря термостабильности он входит в состав огнеупорных, силикатных покрытий, керамических глазурей [26].

     В течение последних 40 лет ксантан  занимает ведущие позиции как  добавка, улучшающая качество самых различных продуктов и технологических операций. Однако, несмотря на большие потребности России в этом полисахариде, в нашей стране в промышленных масштабах ксантан не воспроизводится [27]. 
 

     1.3 Условия культивирования Xanthomonas campestris и факторы, влияющие на биосинтез ксантана 

      Почти все фитопатогенные бактерии, независимо от их таксономической принадлежности, продуцируют внеклеточные полисахариды [5,28]. Бактерии вида X. campestris, вызывающие, в основном, паренхиматозные поражения листьев растений, довольно активно продуцируют ЭПС [29]. Также установлено видовое различие интенсивности их синтеза [30].