Санитарно микробиологический контроль производства мясных консервов

Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем  Е. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

После инкубации из исследуемой  пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.

Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют при комнатной  температуре не менее 15 мин до полного  осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный  и остуженный до (45—49) °С питательный  агар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной  культуры) на 100 мл агара.

В стерильную чашку Петри  пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесью расплавленного и  остуженного до (45—49) °С питательного агара объемом.(12—15) мл, а также  одну дополнительную чашку Петри  для контроля культуры Е. coli и осторожно  покачивают для равномерного перемешивания  пробы воды и агара. Для полного  застывания чашки оставляют на столе  при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат на (18 ±2) ч при 37 °С.

При выполнении серии проб ставится общий контроль для всей серии.

Учет результатов

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете.

Проба считается положительной  при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результат качественный).

При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считается  недействительным.

4.5.2.5. Проведение  количественного анализа

Исследуемую пробу воды в  количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона (по п. 5.2.2) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной  культуры) бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3). В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli.

Для контроля культуры ОД мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой  бульонной культуры) Е. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным  агаром.

Посевы инкубируют при  температуре (37 ± 1) °С в течение 18±2ч.

После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все  исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными  резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной  температуре не менее 15 мин для  осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный  и остуженный до (45—49) °С питательный  агар добавить приготовленный смыв бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь  разлить в чашки Петри: 1 чашку  для контроля культуры Е. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую  пробу воды. При одновременном  анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры Е. coli.

После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей  пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле  надосадочной жидкости (без хлороформа).

После подсыхания капель чашки  с исследуемыми пробами и контрольную  чашку поместить в термостат  при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) ч.

Учет результатов

Просмотр результатов  осуществляется в проходящем свете.

Учет проводится по наличию  зон просветления (лизиса) на секторах газона Е. coli.

При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна  или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.

Проба считается положительной  при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Оценка проводится по таблице  наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). В протоколе  анализа указывается наиболее вероятное  количество колифагов в 100 мл воды и  диапазон возможных колебаний: НВЧ  БОЕ (нижний предел - верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат  считать недействительным.

4.5.3. Прямой метод  определения колифагов

4.5.3.1. Принцип  метода

Определение колифагов в  питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем  его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри с питательным  агаром.

4.5.3.2. Область  определения

Прямой метод выделения  колифагов из воды проводят параллельно  с титрационным при исследованиях  по эпидемическим показаниям.

4.5.3.3. Проведение  анализа

В питательный агар двойной  концентрации (п. 5.3.2), расплавленный  и остуженный до (45—49) °С, добавить смыв Е. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие  пробирки, нагреть до (35—44) °С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить  в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара  с культурой Е. соli.

Для контроля культуры Е. coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до (35—44) °С, залить 20 мл приготовленного  агара с Е. coli и осторожно перемешать.

Содержимое чашек осторожно  перемешать и оставить при комнатной  температуре до застывания. Чашки  с застывшим агаром поместить  дном вверх в термостат и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ±2) ч.

Учет результатов

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшко-образующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной  чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных  бляшек (от 1 до 5—7) мм в диаметре с  четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях  фага наблюдается разная картина  лизиса.

Слияние негативных колоний  дает “ажурный” газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного  лизиса, либо полное отсутствие роста  на чашке.

При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно  застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли  конденсата и негомогенно застывший  при прямом посеве агар могут приводить  к образованию артефактов на газоне Е. coli, визуально напоминающих лизис.

Предварительный учет результатов  можно проводить через (5—6) ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный  ответ о присутствии колифагов  в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 ± 2) ч. Результаты выражают количеством  бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.

Если отмечен сливной  рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: “обнаружено  в 100 мл воды”.

При получении отрицательного результата при работе прямым методом  окончательный ответ выдается по результатам титрадионного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат  исследования считается недействительным.

4.5.4. Постановка  контролей

4.5.4.1. Отрицательный  контроль

Отрицательный контроль подтверждает отсутствие контаминации фагом питательных  сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а также позволяет оценить  способность тест-культуры E. соli давать равномерный газон.

Отрицательным контролем  служит исследование стерильной водопроводной  воды, проводимое аналогично анализируемой  пробе воды. Так, при анализе воды титрационным методом 10 мл стерильной водопроводной воды вносят в дополнительную пробирку. При анализе воды прямым посевом в дополнительную шестую чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды.

Дополнительные посевы исследуются  на колифаги аналогично основным пробам.

При анализе серии проб отрицательный контроль может быть один на каждый вид анализа: титрационный и прямой. В этом случае постановка отрицательного контроля поэтапно осуществляется после обработки всех проб данной серии.

В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с отрицательным  контролем результаты исследования всей серии проб воды недействительны.

Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить  контрольный посев на чистоту  тест-штамма Е. coli K12 F⁺ Str^R.

Кратность проведения отрицательного контроля - 1 раз в день.

4.5.4.2. Методика  подтверждения фаговой природы  лизиса

В сомнительных случаях при  работе как титрационным, так и  прямым методами необходимо провести контрольный посев на подтверждение  фаговой природы лизиса.

С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на колифаги, помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры Е. coli и инкубируют при 37°С в течение (16—18) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом и исследуют на наличие  фага. Высев осуществляют петлей или  пипеткой на сектора питательного агара  аналогично способу, описанному в п. 4.5.2.5. Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение  наличия фага.

 

 

 

4. САНИТАРНО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОЗДУХА НА ПРОИЗВОДСТВЕ

Анализ воздуха проводят по показаниям путем размножения  во  время работы  в  производственных  помещениях открытых чашек Петри со средой для определения ОМЧ и в случаях необходимости со средой для определения количества дрожжей и плесневых грибов.  Чашки выдерживают открытыми 5мин, затем закрывают и термостируют для определения ОМЧ при (30+-1)⁰С в течение 72 ч., для определения дрожжей и плесневых грибов при (24+-1)⁰С в течение 5 суток (ГОСТ 26888-86).

Санитарная оценка воздуха  помещений

 

Объект анализа	оценка
	хорошо			удовлетворительно
	ОМЧ КОЕ	количество		ОМЧ КОЕ	количество
		плесеней	дрожжей		плесеней	дрожжей
	Выросших на чашках Петри			Выросших на чашках Петри
Воздух цеховых предприятий	20-50	До 5	До 5	50-70	До 5	До 5
Воздух остальных помещений  предприятия	30-70	5-10	До 5	70-100	10-15	5-10

 

 

 

     Результаты микробиологических исследований воды и воздуха регистрируют  в лабораторном журнале, где в случае необходимости дополнительно записывают о наличии спор анаэробов в воде и количество плесеней и дрожжей в воздухе. 

Исследования бактериальной  обсемененности

воздушной среды аспирационным  методом 

1. Исследования бактериальной  обсемененности воздушной среды  проводят в помещениях в зависимости  от их функционального назначения  на санитарно-микробиологические  показатели:

- общее количество микроорганизмов  в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб.  м);

- количество колоний S.aureus в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб.  м);

- количество плесневых  и дрожжевых грибов в 1 куб.  м воздуха.

2. Пробы воздуха отбирают  аспирационным методом с помощью  аппаратов и устройств, разрешенных  к применению в установленном  порядке.

Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 куб. дм для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых  грибов и 250 куб. дм для определения S.aureus. Исследование воздуха седиментационным методом не допускается.

3. Для определения общего  количества микроорганизмов в  1 куб. м воздуха забор проб  проводят на питательный агар  типа МПА, СПА, ГРМ-агар и  другие, приготовленные согласно  инструкциям по применению. Посевы  инкубируют при температуре 37 °С в течение (48 +/- 2) ч, подсчитывают  количество выросших колоний  и производят перерасчет на 1 куб.  м воздуха. При наличии роста  колоний дрожжевых и плесневых  грибов их подсчитывают и делают  пересчет на 1 куб. м воздуха.  В протоколе количество дрожжевых  и плесневых грибов указывают  отдельно.

Примечание: При переносе аппаратов и устройств для  отбора проб воздуха из одного помещения  в другое их поверхность обрабатывают раствором дезинфицирующего средства. Столик, внутренние стыки, крышку и  прочие части прибора с внутренней и внешней стороны протирают  спиртом (70%). 

4. Схема бактериологического  исследования на стафилококк.

1. Первый день.

Для определения наличия S.aureus забор проб проводят на желточно-солевые  среды на основе сред: элективно-солевой  агар, стафилококк-агар, маннитол-агар или среда N 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в  термостате при 37 °С (48 +/- 2) ч.

2. Второй-третий день.

На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что  стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную  реакцию в 60 - 70% случаев. Отвивка  на скошенный агар для дальнейшего  исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную  лецитовителлазную реакцию (образование  радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему  исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее  двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат  при 37 °С на (24 +/- 2) ч.