Применение ферментных препаратов в медицине

2.2. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)

Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов, различающихся преимущественно разной электрофоретической подвижностью, хотя и наделенных одинаковой биологической активностью [3]. В этой связи следует более подробно рассмотреть диагностическую значимость двух ферментов, определение изоферментных спектров которых внедрено почти во всех лабораториях клинической химии мира.

Первым из них  является упоминавшаяся выше лактатдегидрогеназа (ЛДГ), которая катализирует обратимое  превращение пировиноградной кислоты в молочную кислоту по уравнению

Следует подчеркнуть, что ЛДГ является ключевым ферментом  анаэробного обмена углеводов во всех живых организмах, определяя  скорость образования энергии в  виде аденозинтрифосфата (АТФ).

ЛДГ - широко распространенный фермент, он синтезируется почти во всех клетках организма человека [3]; различают два типа ЛДГ: так называемый сердечный тип, обозначаемый H-тип (от англ. heart), и мышечный тип, обозначаемый M-тип (от англ. muscle); каждый из них состоит из четырех субъединиц, обозначаемых соответственно цифрами. Если в молекуле ЛДГ все четыре субъединицы представлены H-типом, ее обозначают ЛДГ H4 ; если все субъединицы составлены из M-типа, тогда фермент обозначают M4 . Поскольку в клетках всегда содержатся оба типа молекул H и M, суммарно четыре субъединицы строятся как из H-, так и из M-типов. Таким образом, различают 5 изоферментов ЛДГ, составленных из следующих типов H и M:

H4 , H3M1 , H2M2 , H1M3 и  M4 ;

соответственно  они обозначаются: 1-, 2-, 3-, 4- и 5-й изоферменты  ЛДГ.

При поражениях скелетной мускулатуры, а также при воспалительных процессах печени (гепатиты) или при вирусных поражениях ткани печени [4], и наконец, при отравлении четыреххлористым углеродом или другими ядами, когда преимущественно поражается печень, вызывая некроз ткани [3, 4], изоферментный спектр перемещается слева направо (то есть уровни 5 и 4 изоферментов ЛДГ резко повышаются при почти неизмененном уровне 1 и 2 изоферментов). Эти результаты очень важны для лечащего врача, который на основании главным образом клинической картины болезни, лабораторных данных, электрофоретической картины спектров ЛДГ ставит окончательный диагноз и приступает к лечению больного. Естественно, что методы лечения будут резко отличаться, и в выборе этих методов немалую роль играет изоферментный спектр ЛДГ сердечного или мышечного типа.

2.3. Креатинфосфокиназа 

Вторым ферментом, диагностическая ценность которого еще выше, в особенности при  инфаркте миокарда [3, 4], является креатинфосфокиназа (КФК), катализирующая биосинтез креатинфосфата из креатина и АТФ в соответствии с уравнением

Креатинфосфокиназа - ключевой фермент биосинтеза макроэргического (наделенного или содержащего  высокий энергетический потенциал) субстрата - креатинфосфата, играющего  наряду с АТФ выдающуюся роль в биоэнергетике сердечной мышцы и всего организма. Оказалось, что молекула КФК также состоит из двух типов субъединиц: из M-типа (то есть мышечный тип, от англ. muscle) и B-типа (то есть мозговой; от англ. brain); соответственно выделены и охарактеризованы три изофермента КФК, которые обозначаются латинскими буквами: MM-изофермент (мышечный тип), преимущественно характерный для поперечно-полосатой мускулатуры, BB-изофермент (мозговой тип, преимущественно содержится в ткани мозга) и смешанный тип, обозначаемый MB-изоферментом, который содержится только в сердечной мышце.

Учитывая эти  данные, в частности органотропность  изоферментов КФК, при органических или функциональных поражениях этих тканей в сыворотке крови больного появляются в норме отсутствующие  изоферменты КФК, и, соответственно, они открываются при электрофорезе.

2.4. Аланинаминотрансфераза (АЛТ)

Аланинаминотрансфераза (АЛТ; глутамат-пируваттрансаминаза; GPT, L-аланин: 2-оксоглутаратаминотрансаминаза, КФ 2.6.1.2) катализирует реакцию переаминирования между L-аланином и α-кетоглутаратом:

L-аланин + α-кетоглутарат  ↔ пируват + L-глутамат.

АЛТ - вторая активная аминотрансфераза, выделенная из тканей человека. АЛТ присутствует во многих органах: печени, почках, скелетных  мышцах, миокарде, поджелудочной железе. Невысокая активность АЛТ отмечена и в сыворотке крови здоровых людей. Как и ACT, АЛТ присутствует в клетках в форме двух изоферментов - цитозольного и митохондриального, но последний нестабилен, содержание его в клетке низкое.

Клиническое значение определения концентрации аминотрансфераз.

Повышение активности аминотрансфераз отмечено при ряде патологических процессов, в которые  вовлечена печень. Активность ACT и  АЛТ повышена при остром панкреатите, холецистите, паразитарных заболеваниях, псориазе, ожогах, применении пропионлактона как противовирусного средства, перегрузке организма железом, гепатобилиарной патологии.

Увеличение активности аминотрансфераз можно отметить и у здоровых людей при диете, богатой белком или содержащей 25—30% сахарозы, а также у доноров.

Большое практическое значение имеет упоминание лекарственных

препаратов, обладающих невыраженным гепатотоксическим свойством. К ним на основании накопленного многими исследователями опыта  относят аспирин, индометацин, линкомицин, анаболические стероиды, пероральные контрацептивы, тестостерон и другие андрогены, прогестерон, сульфаниламиды, пиридоксин, барбитураты, препараты меди и железа, антибиотики ( гентамицин, ампициллин, тетрациклин).

Активность ACT в  крови возрастает при туберкулезе  легких, септицемии, герпетической инфекции, вирусном гепатите, опухолях. Активность ACT снижается при малярии и беременности, не меняется при эмболии легочной артерии, пневмониях, абсцессах легкого, ревматоидном артрите. Увеличение активности АЛТ отмечено у пациентов при терапии некоторыми лекарственными средствами, особенно антибиотиками, гиполипидемическими препаратами, кетоацидозе, азотемии.

Исследование  отношения мАСТ/общая активность ACT также было предложено в качестве диагностического теста. Отношение  мАСТ/общая активность ACT снижено при общем гепатите и не изменено при обтурации желчных протоков, алкогольном поражении печени, метастазах в печень. Появление в сыворотке крови высокой активности мАСТ свидетельствует о некротических процессах в гепатоцитах. В остром периоде инфаркта миокарда повышение активности ACT — достоверный диагностический тест. В то же время активность ACT повышена в значительно меньшей степени, чем активность КК или ЛДГ. Клинико-морфологические исследования показали, что динамику активности ACT можно использовать для расчета объема поражения при инфаркте миокарда при небольших очагах некроза миоцитов столь же достоверно, как и на основании активности КК.

Предложено использовать повышение активности ACT в сыворотке  крови как прогностический тест при остром лейкозе.

2.5. Щелочная фосфатаза (ЩФ)

Щелочная фосфатаза (ЩФ) - фосфогидролаза моноэфиров орто-фосфорной  кислоты (КФ 3.1.3.1) - гидролизует разные синтетические субстраты при  оптимуме рН, равном 10,0; субстрат фермента in vivo точно не известен. ЩФ - гликопротеин; по структуре это димер с кажущейся значительной вариацией молекулярной массы фермента в разных тканях. ЩФ - металло-фермент, в состав активного центра фермента входит атом цинка. Полагают, что атом цинка повышает активность фермента, обеспечивая конформационные изменения и гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты. Каждый мономер ЩФ содержит три металлосвязывающих центра. Лишенный ионов цинка фермент теряет активность, но восстанавливает ее после добавления металла. Активность фермента возрастает в присутствии ионов магния, для оптимальной активности необходимо определенное соотношение ионов магния и цинка.

ЩФ присутствует во всех органах человека; наиболее высокая удельная активность фермента обнаружена в эпителии тонкой кишки, эпителии канальцев почек, остеобластах, гепатоцитах и плаценте- фермент плотно связан с клеточной мембраной гидрофобным карбоксильным концом полипептидной цепи; гидрофобный конец цепи идентичен у всех изоферментов ЩФ. ЩФ прикреплена к плазматической мембране с помощью фосфатидилинозитолгликанового якоря. Молекулы ЩФ на поверхности плазматической мембраны располагаются неравномерно.

В организме  человека биосинтез фермента кодируют три гена: один — печеночный, костный  и почечный изоферменты, другой —  кишечный изофермент и третий — плацентарную ЩФ. Полагают, что существует и 4-й ген, кодирующий синтез зародышевой ЩФ. Последняя локализована в тонкой кишке плода примерно до 30 недель беременности. Эмбриональные и зрелые формы ЩФ сходны по каталитической активности. Выделение ЩФ из ткани печени с помощью фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы приводит к образованию форм, сходных с присутствующими в сыворотке крови. Эти данные позволяют считать, что формы ЩФ сыворотки крови образуются путем ферментативного гидролиза тканевых форм.

Клиническое значение определения активности ЩФ.

Повышение активности ЩФ в сыворотке крови не всегда позволяет с достаточной степенью достоверности составить представление  об органотопической патологии.

В клинической  биохимии активность ЩФ наиболее часто используют в диагностике патологии гепатобилиарной системы и костной ткани. Активность ЩФ сыворотки крови часто повышена при обструктивных заболеваниях печени, холестазе, гепатите, явлениях гепатотоксичности, болезни Педжета, остеомаляции, новообразованиях, вовлекших в патологический процесс печень и костную ткань.

Низкая или  даже неопределяемая активность ЩФ отмечена при гепатолентикулярной дегенерации. Механизм этого феномена неясен, предполагают, что ион меди конкурирует с  цинком за место в активном центре ЩФ, что ведет к резкому падению активности фермента. Применение гиполипидемических препаратов, в частности клофибрата, также ингибирует фермент.

У недоношенных детей с целью ранней диагностики  рахита рекомендовано определять активность ЩФ.

Исследование  активности ЩФ у больных с синдромом  гипофосфатазии указывает на важную роль ЩФ в процессах минерализации  костной ткани. Синдром гипофосфатазии - врожденное заболевание костной  ткани, характеризующееся избирательной  недостаточностью синтеза ЩФ. У пациентов с подобной патологией в тканях и сыворотке крови значительно снижена активность печеночного, костного и почечного изоферментов ЩФ при нормальной активности плацентарного и кишечного изоферментов. Другая особенность заболевания - накопление в крови и моче фосфорсодержащих комплексов, служащих эндогенным субстратом ЩФ. К ним относят фосфоэтаноламин, пирофосфат, П-5-Ф и т. д. Заболевание вызвано точечными мутациями гена, кодирующего синтез фермента.

Повышение активности ЩФ происходит не только в условиях активного роста костной ткани, но и при ее разрушении - остеопорозе и последующей остеомаляции. При тяжелом остеопорозе и остеомаляции активность ЩФ в сыворотке крови может быть нормальной или слабо повышенной (в 2—3 раза). Остеомаляция, верифицированная гистологически, может протекать при нормальной активности ЩФ.

Активность ЩФ в сыворотке крови может быть повышена при остеомиодистрофии, развивающейся  как осложнение длительного гемодиализа. При введении циклоспорина после  трансплантации повышенная активность ЩФ в большей мере зависит от токсического влияния препарата на гепатоциты и в меньшей мере связана с патологией остеобластов. У пациентов с гиперпаратиреозом активность ЩФ сыворотки крови обычно в пределах нормы, но при развитии остеопороза, особенно остеонекроза, может быть значительно увеличена.

Исследование  активности ЩФ оказывается полезным и в дифференциальной диагностике  внутри- и внепеченочного холестаза. В случае экстрагепатобилиарной  обструкции при камнях желчного протока  и желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается в 10 раз и более. Внутрипеченочная обструкция желчных путей при гепатите также сопровождается повышением активности ЩФ, но степень гиперферментемии не превышает 2—3-кратного значения. Острые некротические изменения гепатоцитов могут не сопровождаться повышением активности ЩФ до тех пор, пока в патологический процесс не будут вовлечены желчные канальцы и не произойдет задержка желчеотделения. В то же время далеко не во всех случаях поражения паренхимы печени существует четкая корреляционная зависимость между активностью ЩФ сыворотки крови и содержанием в ней билирубина. В начале развития внутрипеченочного холестаза увеличение активности ЩФ может быть следствием повышения синтеза белка в гепатоцитах; последующее повышение активности ЩФ в сыворотке крови, особенно в форме макро-ЩФ, связано с нарушением целостности клеток желчных канальцев.

2.6.g-Глутамилтранспептидаза (ГГТ)

В последние  годы в клинической химии подобающее место заняло определение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ; у-глутамил-транспептидазы, КФ 2.3.2.2).

ГГТ катализирует перенос у-глутамила на аминокислоту или пептид, на другую молекулу субстрата  или воду. ГГТ - белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 90 кДа. Фермент содержит гидрофильный и гидрофобный фрагменты. Активный центр расположен на гидрофильном участке полипептидной цепи. Гидрофобная область — часть цепи, которой фермент прикреплен к мембране. Если экстракцию фермента из тканей провести с использованием в качестве детергента желчных кислот или тритона \ Х-100, ГГТ вместе с гидрофобным участком может быть переведена в раствор. Если в экстрагирующую смесь включены только протеазы (папаин или трипсин), гидрофобный фрагмент ГГТ остается на мембране, а в растворе оказывается гидрофильная часть полипептида ГГТ.