Исследования по фармакогностическому изучению и стандартизации препаратов грецкого ореха

     Наличие радионуклидов определяли на сцинтилляционном γ- спектрометре МКГБ-01 по методике ОФС 42-0011-03.

     Испытания на микробиологическую чистоту проводились  в соответствии с ГФ XI (вып.2), изменениями № 3 к ГФ ХI от 19.03.03.

      УФ - спектры поглощения записывали на приборе              «GELIOS – γ» (США).

      Анализ  методом ВЭЖХ проводили на хроматографе марки «GILSON» (Франция), а также  на хроматографе  марки «SHIMADZU» (Япония) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows».

      Изучение  производных нафтохинона осуществляли методом ЯМР-¹³С спектроскопии на приборе АС-200 фирмы «Bruker», используя в качестве растворителей ацетон и метанол.

     В аналитических исследованиях применяли статистические расчеты принятые ГФ ХI (вып.1, С.199) с использованием критерия Стьюдента.

     Настойки  гомеопатические матричные, полученные из свежих и высушенных листьев ореха грецкого и их разведения (D4, D3, D2 и D1) исследовали методами in vivo и in vitro на молекулярных тест-системах: каталаза (КАТ), глутатионпероксидаза (ГП) и глутатионредуктаза (ГР). 

     2.Фармакогностический анализ ореха грецкого листьев свежих и высушенных

     В ходе исследования определены макро- и микродиагностические признаки ЛРС, а также установлены нормативы таких числовых показателей как влажность, содержание тяжелых металлов,  измельченность, содержание минеральной и органической примеси, золы общей и нерастворимой в 10%  растворе кислоты хлористоводородной, экстрактивных веществ, микробиологическая чистота и наличие радионуклидов.

     При определении морфолого-диагностических  признаков сырья ореха грецкого листьев было установлено, что цельное  сырье представляет собой цельные  или частично измельченные листочки яйцевидной или обратнояйцевидной формы непарноперистосложного листа, сверху темно-зеленые, блестящие, снизу более светлые и матовые, в углах жилок с бородками волосков. Запах слабый, специфический. Цвет темно-зеленый с сероватым оттенком. Вкус водного извлечения горько-пряный.

     Измельченные  листья ореха грецкого представляют собой кусочки цельнокрайних  листочков различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями размером  2 мм сверху темно-зеленые, блестящие, снизу более светлые и матовые, в углах жилок с бородками волосков. Цвет темно-зеленый с сероватым оттенком. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения специфический, слегка вяжущий.

     К специфичным микродиагностическим признакам ореха грецкого листьев  следует отнести наличие на эпидермисе листовой пластинки многоклеточных железистых волосков  расположенных вдоль жилок, 6-8 клеточных железок, заполненных темно-окрашенным смолистым веществом, а также извилистостенность эпидермиса и наличие устьиц аномоцитного типа.

    Кроме того, определена микробиологическая чистота анализируемого сырья и содержание в нем радионуклидов.

    В результате проведенных исследований для ЛРС установлены пределы  нормирования, представленные в таблице 1.

     Полученные  показатели включены в проект ФС «Ореха грецкого листья свежие» и «Ореха грецкого листья». 
 
 
 
 
 
 
 
 

    Таблица 1

Числовые  показатели качества сырья ореха  грецкого листьев свежих и высушенных

 

3. Фитохимическое изучение и определение показателей качества ореха грецкого листьев свежих и высушенных

     Для изучения качественного состава  БАВ и  определения  подлинности  сырья использовали сок и водные или водно-спиртовые (спирт этиловый 70 %) извлечения из высушенных ореха грецкого листьев в соотношении (1:10) (Таблица 2). 
 

Таблица 2

Результаты  качественного фитохимического анализа

Условные обозначения: "+++" – высокое содержание БАВ; "++" - умеренное содержание БАВ; "+"  - следы БАВ; "-" БАВ отсутствуют; 

      Полученные  данные предварительного фитохимического анализа свидетельствуют о том, что основными группами БАВ ореха грецкого листьев как свежезаготовленных, так и высушенных являются фенольные соединения:  флавоноиды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, а также нафтохиноны. Такие группы БАВ как кумарины, алкалоиды, терпеноиды, сапонины и сердечные гликозиды отсутствуют или представлены в следовых количествах и дальнейшего интереса для исследований не представляют.

     Изучение состава отдельных групп БАВ осуществляли методом ВЭЖХ на приборе LC-10AVP  фирмы SHIMADZU, хроматографическая колонка ZORBAX 80A Extend-C 18, 5 μм производства фирмы Agilent (США) длиной 250 мм.

    В качестве подвижной фазы - 0,1 % H₃PO_4, метанол,  скорость потока: 1 мл/мин, температура термостата 30° С. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 340 нм. В хроматограф вводили по 20 мкл исследуемых растворов и растворов стандартных образцов (СО). Результаты исследований приведены на рисунке 1. 

    

 

Рис.1. – ВЭЖХ-хроматограмма фенольных соединений сока листьев ореха грецкого свежих: 1 – галловая кислота, 2 – хлорогеновая кислота,   3 – гиперозид, 4 – юглон 

    На  хроматограмме идентифицированы пики галловой и хлорогеновой кислот, гиперозида и нафтохинона – юглона,  которые совпадают с таковыми пиками стандартных образцов. Приведенная методика включена в раздел «Подлинность» проекта ФС на ореха грецкого листья свежие и высушенные. Поскольку для разработки методов количественного определения БАВ необходимы стандартные образцы, то представлялись актуальными исследования, связанные с изучением компонентного состава нафтохинонов листьев ореха грецкого и выделение преобладающего соединения, как возможного стандартного образца. Использование метода ВЭЖХ позволило определить, что этим соединением является 5-гидрокси-1,4-нафтохинон – юглон. Следующим этапом исследований явилась разработка схемы его выделения, очистки и установления структуры.

                                                                                            

Юглон

(5-окси-1,4-нафтохинон)               альфа-гидроюглон                            бэта-гидроюглон 

     Выделенный  комплекс нафтохинонов и очищенный  юглон были исследованы методами ВЭЖХ, УФ- спектрофотометрии, ЯМР – С¹³ спектроскопии и определены его растворимость, температура плавления (Таблица 3).

      Данные, представленные в таблице свидетельствуют  о схожести физико-химических характеристик  СО юглона (Aldrich № H 47003) и соединения (Ю1), выделенного из листьев ореха грецкого.

    Это подтверждает правильность разработанного способа выделения производных  нафтохинона из ЛРС и эффективность  способов их очистки.

Таблица 3

Сравнительная характеристика юглона – стандартного образца и юглона, выделенного  их листьев ореха грецкого

 

    С использованием СО галловой кислоты, гиперозида и юглона методом ВЭЖХ идентифицированы и количественно определены суммы дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту,  суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид и суммы нафтохинонов в пересчете на юглон. Результаты представлены в таблице 4. 
 
 

    Таблица 4

Результаты  количественного определения содержания

основных  групп БАВ в ореха грецкого листьях.