Исследования по фармакогностическому изучению и стандартизации препаратов грецкого ореха

     По  результатам определения содержания БАВ предложены следующие  нормы  для проектов ФС: содержание дубильных веществ (в пересчете на галловую кислоту) не менее 14 % - для свежего и не менее 12%  для высушенного сырья; содержание флавоноидов (в пересчете на гиперозид) не менее 1 %  - для свежего и не менее 0,9 % - для высушенного сырья; содержание нафтохинонов (в пересчете на юглон) не менее 5 % - для свежего и не менее 4,2% - для высушенного сырья;

    С использованием разработанных методов качественного и количественного анализа определены оптимальные сроки заготовки сырья и срок годности  листьев ореха грецкого свежих и высушенных.

   Динамика  накопления БАВ была изучена на примере галловой кислоты и юглона в ореха грецкого листьях свежих в зависимости от фазы вегетации. Исследование проводили методом ВЭЖХ, описанным ранее. Полученные данные представлены на рисунке 2.  

Рис. 2. – Динамика накопления нафтохинонов  (1) и дубильных веществ (2) в листьях ореха грецкого. 

        Согласно полученным данным максимальное  содержание дубильных веществ и нафтохинонов в листьях  ореха грецкого отмечено в фазу цветения. Именно в этот  (июнь – июль) период и следует осуществлять заготовку сырья. На основании полученных данных составлены  инструкции по заготовке листьев ореха грецкого свежих и  высушенных.

    Результаты  комплексных исследований  позволяют  сделать вывод о том, что  сырье  листья ореха грецкого свежие необходимо хранить не более 24 часов при температуре не выше 4° С в холодильной камере, а высушенные листья – не более 3 лет в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 15 ⁰С. Полученные данные вошли в раздел проекта ФС «Срок годности».

     При определении содержания основных группы БАВ в свежем и высушенном сырье было установлено, что содержание дубильных веществ в обоих видах сырья находиться на одном уровне, однако содержание флавоноидных соединений и нафтохинонов в свежем сырье выше. Это обусловлено биохимическими процессами, протекающими в сырье при его сушки и, прежде всего, эти процессы оказывают влияние на нафтохиноны, структура которых достаточно лабильна, и, как отмечалось ранее, они легко трансформируются в гидроксиюглоны.  
 
 

    4.Получение настоек гомеопатических матричных Югланс и разработка методов их стандартизации

    На  основании данных проведенного анализа  ЛРС и в соответствии с требованиями ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические  матричные» для приготовления НМГ  из свежего ЛРС использовали метод 2, так как влажность свежего ЛРС составляет менее 70 % и не установлено наличие в нем эфирных масел и слизей. Для получения НГМ из высушенного сырья использовали метод 4. Полученные НГМ Югланс подвергали анализу с целью выбора методик определения их  качества.

    Для подтверждения параметров качества НГМ из свежего и высушенного  сырья был использован принцип  сквозной стандартизации. Так, для характеристики подлинности НГМ Югланс предложена реакция Борнтрегера на наличие нафтохинонов. Представляется целесообразным включить эту реакцию в раздел «Подлинность» ФС на НГМ как из свежего, так и из высушенного сырья. 

     Дополнительно в НД на НГМ предложено проведение реакции с раствором йода для подтверждения наличия спирта этилового и спектрофотометрия в УФ- и видимой областях спектра  с использованием разведения исходных НГМ спиртом этиловым                70 % в соотношении 1:75, с целью определения наличия фенольных  соединений. Согласно полученным данным спектр поглощения исследованных НГМ Югланс имеет 2 максимума поглощения в интервале длин волн 220-600 нм: 250 ±2 нм,425±2 нм (рис.3)

Рис. 3. – УФ-спектр НГМ Югланс:  1 - из свежих листьев ореха грецкого; 2 - из высушенных листьев ореха грецкого

     Для уточнения состава фенольных соединений были разработаны условия проведения ТСХ как ЛРС, так и настоек на их основе с использованием в качестве неподвижной фазы  хроматографических пластин  «KISELGEL 60 F 254» размером 20х20 см, в качестве подвижной фазы смеси растворителей:  этилацетат–метилэтилкетон–муравьиная кислота-вода в соотношении 10:6:2:2. Результаты исследования ТСХ НГМ Югланс на присутствие фенольных соединений представлены  в таблице 5.

     Разработанная методика ВЭЖХ анализа фенольных  соединений на хроматографе жидкостном с ультрафиолетовым детектором LC-10AVP производства фирмы SHIMADZU,  колонка ZORBAX 80A Extend-C 18, 5 μм производства фирмы Agilent (США) позволила определить качественно и количественно содержание БАВ как в ЛРС, так и в НГМ, полученных на их основе. Результаты количественного определения основных БАВ в НГМ из свежего и высушенного сырья представлены в таблице 6.

     По  результатам определения содержания БАВ предложены следующие  нормы  по этим показателям для проектов ФС: содержание дубильных веществ (в пересчете на галловую кислоту) не менее 10 % - для НГМ из свежего и не менее 9% для высушенного сырья; содержание флавоноидов (в пересчете на гиперозид) не менее 0,7 %  - для НГМ из свежего и не менее 0,6 % - для НГМ из высушенного сырья; содержание нафтохинонов (в пересчете на юглон) не менее 3,7 % - для НГМ из свежего и не менее 2,9 % - для НГМ из высушенного сырья.

     Таблица 5

Результаты  исследования ТСХ НГМ на присутствии фенольных соединений.

     Таблица 6

     Результаты  количественного определения основных групп БАВ в НГМ Югланс

     Также в настойках определены плотность, сухой остаток, содержание тяжелых металлов в соответствии с требованиями ГФ Х1 и установлены условия и сроки их хранения (таблицы стабильности). Норма по плотности НГМ предложена - от 0,951 до 0,980 для НГМ из свежего сырья и от 0,953 до 0,981 – из высушенного, по сухому остатку - не менее 3% и не менее 1% соответственно.

      Микробиологические  испытания проводили с предварительным  снятием антимикробной активности путем разведения НГМ. Определена  категория чистоты - 3.2.  

5.Исследования  основных видов  фармакологической активности НГМ Югланс

     В рамках фармакологических исследований на животных было проведено определение  острой токсичности настоек гомеопатических  матричных и установления наличия противовоспалительной (антипролиферативной, антиэкссудативной и  антиальтеративной) активности.

     Антимикробное действие определялось методом биотестирования, с использованием специфических ферментных тест-систем в опытах in vitro. В результате проведенных исследований установлено, что настойки матричные  гомеопатические из свежих и высушенных листьев ореха грецкого проявляют специфическое сродство к антиоксидантным ферментам, угнетая  в разной степени активность ГП и КАТ, что создает условия для окислительного стресса в бактериальных клетках.

     Таким образом, в основе фармакологического действия НГМ Югланс, полученных из свежих и высушенных листьев ореха грецкого, возможно, наряду с другими механизмами, лежит их способность угнетать ферменты системы антиоксидантной защиты. Снижение скорости КАТ и ГП – реакций приводит к накоплению активных форм кислорода в клетках микроорганизмов, создавая условия для усиления перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот клеточной мембраны, окислению белковых структур и нуклеиновых кислот. В результате, образующиеся в матриксе клетки кислородные радикалы, окислительный стресс и недостаточная активность ферментов антиоксидантной защиты приводит к остановке роста и гибели микроорганизмов и свидетельствует о наличии выраженного антимикробного действия.

     Острую  токсичность настойки гомеопатической матричной листьев грецкого ореха оценивали на белых нелинейных мышах-самцах массой тела 18-22 г. Для определения средней летальной дозы (LD₅₀) использовали метод Миллера-Тейнтера. Установлена низкая токсичность настоек.

      Сделан  вывод о  наличии выраженного противовоспали-тельного действия, близкого к диклофенаку, по проявляемым антиэкссудативным и антипролиферативным эффектам. НГМ из листьев грецкого ореха, ее разведения D3 и С1 обладают антиульцерогенным действием, сравнимым по активности с гастропротектором – «Сукральфат». Таким образом, показана целесообразность использования исследованных гомеопатических растительных средств в качестве гастропротектора.  
 

Общие выводы 

1. Впервые проведено  морфолого-анатомическое изучение сырья ореха грецкого листьев свежих и высушенных, выявлены основные диагностические признаки и изготовлены микрофотографии. Разработана номенклатура числовых показателей свежих и высушенных ореха грецкого листьев.
2. Исследован химический состав ореха грецкого листьев (свежих и высушенных) и установлено наличие в них таких групп БАВ, как дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, нафтохиноны. Разработаны методики качественного и количественного анализа изучаемого сырья по содержанию в нем флавоноидов (гиперозид), дубильных веществ (галловая кислота), нафтохинонов (юглон), а также разработана схема выделения юглона и определены его основные физико-химические характеристики.
3. Изучена динамика накопления БАВ в ореха грецкого листьях, установлено, что максимум накопления действующих веществ приходится июнь – июль.
4. Предложена технология получения НГМ Югланс их свежего и высушенного сырья и проведено изучение их химического состава с использованием методик химического и физико-химического анализа, разработаны методики контроля качества НГМ Югланс.
5. Определены основные показатели качества настоек: плотность, сухой остаток, подлинность, количественное содержание, содержание тяжелых металлов, определены условия их хранения и установлены сроки годности
6. Проведено определение фармакологической активности настойки гомеопатической матричной Югланс и ее основных фармакологически активных компонентов. Установлено наличие противовоспалительных, ранозаживляющих, гастропротекторных и антимикробных свойств.
7. Разработаны проекты ФС на: «Ореха  грецкого листья», «Ореха грецкого листья  свежие», «Juglans regia (Juglans) настойка гомеопатическая матричная» «Juglans regia (Juglans) D1. Настойка гомеопатическая матричная». Разработан проект инструкции по заготовке листьев ореха грецкого.