Влияния холодового стресса на изменение активности антиоксидантного фермента – каталазы в листьях растений томатов

 

2.3.1 Способы снижения образования АФК

Активация цианид-резистентной альтернативной оксидазы в ЭТЦ митохондрий. В результате такой активации энергия электрохимического потенциала не переходит в АТФ, а рассеивается в виде тепла. При стрессовых воздействиях альтернативная оксидаза обычно активируется.

Утечка ионов  водорода. Образование пероксида водорода митохондриями клеток животных весьма заметно при дефиците АДФ, т.е. при невозможности образования электрохимического потенциала, а затем АТФ. Для прекращения накопления Н₂О₂ достаточно даже небольшого снижения электрохимического потенциала, вызываемого введением АДФ. Такой эффект может достигаться и при небольшой утечке ионов водорода, не сопряженной с синтезом АТФ. Возможно, митохондрии располагают механизмом увеличения утечки протонов в состоянии покоя. Этот механизм мог бы предотвратить полное торможение дыхания, сильное восстановление дыхательных ферментов и коферментов. Действуя на внутриклеточном уровне, он должен включаться, когда АДФ исчерпывается, и выключаться, когда АДФ появляется вновь.

Открывание пор  в мембране митохондрий. Если система утечки протонов оказывается недостаточной, включается более радикальный путь, ведущий к той же цели. Подобную роль могут играть поры на внутренней мембране митохондрий, образующиеся в определенных специфических условиях. Они проницаемы для веществ массой не более 1,5 Д, и их открывание выравнивает все градиенты, включая градиенты концентрации Н⁺ и субстратов дыхания.

Поры способны открываться в  ответ на накопление АФК, т.е. увеличение концентрации О₂^-·, Н₂О₂ или НО^· служит сигналом для открывания пор. Это приводит к гораздо более сильной утечке протонов, стимуляции дыхания и к более быстрой ликвидации О₂. Когда концентрация кислорода падает, скорость накопления АФК уменьшается, и поры закрываются. Для того, чтобы поры открылись, требуется некоторое снижение электрохимического потенциала, т.е. утечка протонов, по-видимому, предшествует открыванию пор.

Активирование фотодыхания. Этот способ снижения образования АФК особенно важен для зеленых частей растения, которые, осуществляя фотосинтез, постоянно подвергаются действию светового излучения и высоких концентраций кислорода. Например, у хлореллы фотодыхание вовлекается в устранение окислительного стресса через НАДФН-зависимый синтез осмопротектора пролина, активирующийся в ответ на повышение концентрации NaCl . 

 

2.3.2 Система антиоксидантной  защиты

Поддержание концентрации уже образовавшихся в клетке АФК (активные формы кислорода) на достаточно низком уровне и локализацию  их действия осуществляет специализированная многокомпонентная антиокислительная система АОС (антиоксидантная система) от состояния которой во многом зависит устойчивость растений к стрессовым воздействиям.

В настоящее время число соединений, относимых к антиоксидантам, постоянно  возрастает, однако их универсальной  классификации пока нет. Наиболее удобно характеризовать группы антиоксидантов в зависимости от их молекулярных масс, при этом первую группу составляют низкомолекулярные соединения, а  вторую – высокомолекулярные ферменты, белки и пептиды, способные связывать  ионы металлов переменной валентности.

Важнейшими высокомолекулярными антиоксидантами растений, непосредственно обезвреживающими АФК, выступают специализированные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и т.д.), способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ, и белки, способные связывать металлы с переменной валентностью. Ферменты-антиоксиданты, обеспечивающие комплексную защиту биополимеров от АФК, расположены в различных клеточных компартментах, имеют разную субстратную специфичность и сродство с активными формами кислорода.

Ферменты АОС принимают  участие в регуляции метаболизма  в ходе онтогенеза и имеют особую важность для растений в обеспечении  быстрой приспособленности к  постоянно меняющимся условиям внешней  среды. Наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же каталитическую функцию, – весьма ценное свойство, расширяющее адаптационные возможности  организма, что особенно важно для  жизнедеятельности растений – организмов, не имеющих стабильной внутренней среды .

При окислительном стрессе  ферментативная антиоксидантная система  может становиться неэффективной. Причины этого – быстрая инактивация  конститутивного пула ферментов  свободными радикалами, значительное время необходимое для индукции их синтеза. В этих условиях повышается значение низкомолекулярных неферментативных антиоксидантов .

Низкомолекулярными антиоксидантами  являются различные по структуре  и химическим свойствам соединения, способные взаимодействовать с  кислородными и органическими радикалами, ингибировать протекание свободнорадикальных  процессов в клетках. Механизм их действия состоит в том, что они  подставляют себя под удар реактивных производных кислорода (О₂^*, О₂^-∙, ^•ОН, Н₂О₂ и т.п.) и окисляясь, прерывают опасную для клетки цепь реакций. Однако неферментативные низкомолекулярные антиоксиданты являются менее эффективной антиоксидантной системой по сравнению с ферментативной. От состояния АОС во многом зависит устойчивость растений к стрессовым воздействиям. 

 

2.3.3 Антиокислительные ферменты

Детоксикация АФК посредством  ферментативных процессов возможна, если константа реакции с АФК  при физиологических условиях достаточно низкая. Поэтому катализируемая ферментами детоксикация касается главным образом  супероксида, пероксидов и эпоксидов, как более или менее «стабильных» восстановленных форм кислорода.

У высших растений, водорослей и цианобактерий  эти АФК удаляются индивидуально  либо кооперативно такими ферментами, как СОД, каталаза, пероксидаза, аскорбатпероксидаза, моно- и дегидроаскорбатредуктазы, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, гваяколпероксидаза и др. Индивидуальные физиологические параметры или  стрессы могут индуцировать разные ферменты.

Ферментативные антиоксиданты  характеризуются высокой специфичностью действия, направленной против определенных АФК, специфичностью клеточной и  органоидной локализацией, использованием в качестве катализаторов металлов (Сu, Zn, Мn, Fе).

Супероксиддисмутаза (СОД) – один из ключевых ферментов антиоксидантной защиты. Она существенно ускоряет реакцию дисмутации супероксида с образованием пероксида водорода и молекулярного кислорода.

СОД имеет несколько изомерных  форм, различающихся по первичной  структуре, молекулярной массе и  природе металлов, входящих в активный центр. Ее медь-цинковая форма (Сu-Zn-СОД; мол. м. 30-33 кД) содержится в цитозоле, межмембранном пространстве митохондрий, пероксисомах; Мn-СОД (мол. м. 75-94 кД) – в матриксе митохондрий, пероксисомах, обнаруживается также у бактерий; Fе-СОД (мол. м. 36-48 кДа), характерна для микроорганизмов, зафиксирована в пероксисомах и митохондриях (Меньшикова, Зенков, 1993; Липкин, 1995; Чиркова, 2002). В хлоропластах растений основным фактором элиминирования О₂ также является СОД. Здесь обнаружены мембраносвязанная и стромальная формы фермента: Сu-Zn-СОД и Fе-СОД. Структура и свойства СОД изучены достаточно полно. Фермент термостабилен и выдерживает нагревание при 100°С в течение 1 мин, а также устойчив к колебаниям рН в диапазоне от 2 до 12 (Меньшикова, Зенков, 1993).

Механизм взаимодействия СОД с  супероксидным радикалом точно  не выяснен. Предполагается, что сначала  одна молекула супероксида взаимодействует  с активным центром фермента, при  этом металл, входящий в активный центр, восстанавливается, а супероксидный  радикал окисляется до молекулярного  кислорода:

Cu²⁺ + O₂^·- → Cu⁺ + O₂

Затем при участии второй молекулы супероксидного радикала происходит обратное окисление металла, при этом супероксид восстанавливается до пероксида  водорода:

Cu⁺ +O₂^·- + 2H⁺ → Cu²⁺ + H₂O₂

Каталаза  – оксидоредуктаза с молекулярной массой около 250 кД. Это двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенной с ним простетической группы, последняя содержит гематин. Установлено, что каталаза содержит 0,09% железа, т.е. 4 атома железа на 1 молекулу фермента .Оптимум действия каталазы при рН 6,5; в более кислых и щелочных средах активность уменьшается.

Каталаза катализирует распад Н₂О₂ до Н₂О и О₂:

2Н₂О₂→2Н₂О+О₂

Процесс осуществляется в 2 этапа:

Fе²⁺-каталаза + 2Н₂О₂ → окисленная каталаза;

окисленная каталаза + Н₂О₂ → Fе³⁺-каталаза + 2Н₂О + О₂.

Один фермент способен вызывать распад 6∙10⁶ молекул пероксида водорода в секунду (Островская, 1953).

Каталаза локализована преимущественно  в пероксисомах и глиокисомах, специфическая  изоформа обнаружена также в митохондриях, активность ее обнаружена и в хлоропластах растений. В окисленном состоянии  каталаза может работать и как  пероксидаза, катализируя окисление  спиртов или альдегидов (Меньшикова, Зенков, 1993). Существенна также роль каталазы в снабжении кислородом тех участков тканей, куда доступ его  в силу тех или иных причин затруднен. Биологическая роль каталазы тесным образом связана с нормальной функцией цитохромной системы. Активность каталазы варьирует в зависимости  от источника получения фермента. Каталаза ингибируется сенильной кислотой, сероводородом, фторидами. Наиболее сильное  торможение на активность каталазы оказывает  нитрат-ион (Кретович, 1986; Чиркова, 2002).

Пероксидазы– двухкомпонентный фермент класса оксидоредуктаз, состоящий из гематина С₃₄Н₃₂О₄N₄Fе(III)ОН (низкомолекулярного кофермента, содержащего железо) и апофермента (белковой частицы, составляющей основную часть фермента)

Пероксидаза – обширная группа ферментов, катализирующих реакции окисления  органического и неорганического  субстрата с использованием пероксида  водорода или органических пероксидов в качестве акцепторов электронов:

2ХН + Н₂О₂ → 2Х + 2Н₂О;

2ХН + ROOH → 2X + Н₂О + ROH,

где ХН – восстановленный субстрат, Х – окисленный субстрат.

Пероксидазы присутствуют в различных  компартментах клетки: хлоропласты, митохондрии, пероксисомы, цитозоль.

Ингибиторами пероксидазы могут  служить все вещества, которые  способны образовать с железом соединения, разрывающие хотя бы одну из связей в гемпротеиновом комплексе, или  делают невозможным доступ перекисей  к железу и таким путем обратимо или необратимо инактивируют фермент .

2.3.4 Причины гибели растений от мороза

Одной из наиболее ранних реакций  на охлаждение является окислительный  стресс. Усиление перекисного окисления  липидов происходит благодаря накоплению активных форм кислорода. Изменяется соотношение ненасыщенных и насыщенных жирных кислот. Возможно, именно это является началом холодового повреждения плазмалеммы, мембран митохондрий и хлоропластов, повышения их проницаемости. Происходит повышение вязкости липидной фазы мембран, нарушаются функции мембранных белков, работа транспортных систем клетки. Плазмалемма теряет полупроницаемость. Свойства мембран изменяются еще и благодаря выходу растворенных веществ из клеток. Нарушается работа ферментов, локализованных на мембранах хлоропластов и митохондрий, и связанные с ними процессы окислительного и фотосинтетического фосфорилирования. Интенсивность фотосинтеза снижается, уменьшается отток ассимилятов. Именно изменение свойств мембран является первой причиной повреждения клеток. В некоторых случаях повреждение мембран наступает при оттаивании. Таким образом, если клетка не прошла процесса закаливания, цитоплазма свертывается из-за совместного влияния обезвоживания и механического давления образовавшихся в межклетниках кристаллов льда.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1  Растительный материал.

В работе использовали растения томатов, сорт “Медвежья лапа”.». Из плодов растений, выросших на станции искусственного климата «Биотрон», собирали семена и использовали в работе.

 

 

 

Растворы для определения  активности каталазы:

• Трис-HCl pH 7,8;
• 0,03% Н₂О₂;
• 4%  (NH)₄Mo O₄

2.1.4 Оборудование.

В работе использовали весы аналитические ЕР114С, рН-метр (Annoer 4100, Германия), автоклав (Sanyo, 48л, США), вытяжной шкаф ЛАБ1200, сушильный шкаф ШС 80-01(350), ламинарный бокс (“Ehret”, Германия), ФЭК.

2.2 Методы

2.2.5 Колориметрический метод определения активности каталазы.

2.2.5.1 Приготовление экстракта.

В качестве исходного материала  для исследований использовался  экстракт стеблей и листьев томатов.

Исследуемые образцы:

1.Контроль (неколонизированные растения)

2. Колонизированные Pseudomonas aureofaciens BS1393.

3. Колонизированные  Methylovorus mays ВКМ В-2221.

   Экстракт приготавливали путем гомогенизации 0,5 г листьев и стеблей с небольшим количеством оксида алюминия и дистиллированной воды. Затем полученную массу переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Экстракт немедленно фильтровали и использовали для исследований.