Влияния холодового стресса на изменение активности антиоксидантного фермента – каталазы в листьях растений томатов

Введение

Действуя на растительный организм, неблагоприятные факторы  среды вызывают в нем разнообразные  ответные реакции. Многие из них, к которым  растение эволюционно не приспособлено, могут оказывать стрессовое воздействие  на организм, приводящее к различным  физико-химическим аномалиям, повреждению  их структур и метаболических функций . К одним из наиболее значимых факторов, определяющих географическое распространение  и продуктивность растений, относится  температура. Действие низких температур, вымерзание посевов и насаждений наносят сельскому хозяйству  большой ущерб, что усугубляется снижением урожайности тех растений, которые выживают. Все они подвергаются воздействию пониженных температур различной длительности, причем из них только пшеница обладает относительно высокой степенью устойчивости к низким температурам . В силу этого внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии. На основании ряда исследований выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизм повреждений от мороза, а также устойчивость и адаптацию некоторых видов к отрицательным температурам, тогда как устойчивость группы холодостойких растений к низким положительным температурам изучена гораздо меньше. По этой причине исследованиям физиологических и молекулярных основ холодостойкости следует уделить больше внимания. Существует также потребность в точной оценке адаптивного потенциала этих растений, которая невозможна без изучения их устойчивости и повреждений при стрессовых воздействиях окружающей среды.

Общий адаптационный синдром, чаще называемый как стресс, представляет собой комплекс ответных реакций  организма на внешние воздействия, по силе превосходящие обычные физиологические, и при длительном воздействии  заканчивающиеся развитием патологий. Представления о действии на клетки низких температур и морозов значительно  изменились и расширились в связи  с установлением взаимосвязей между  различными видами стресса и выделения  группы неспецифических реакций. К  неспецифическим реакциям относится  обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) окислительный  стресс, который зафиксирован как  один из самых ранних эффектов охлаждения. Такое накопление высокоактивных соединений приводит к возникновению каскада свободно-радикальных реакций и называется окислительным стрессом, который считается одной из первопричин повреждения белков и ДНК, а также увеличения проницаемости мембран. Известно, что система противодействия окислительному стрессу состоит из двух компонентов: антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных веществ-антиоксидантов. На основании общепринятых представлений, базирующихся на исследовании, главным образом, теплолюбивых растений, ведущая роль в защите растений от АФК принадлежит антиоксидантным ферментам. Показано, что на самых ранних этапах окислительного стресса баланс окисленных и восстановленных соединений сдвигается в сторону окисления, а при достижении высокого уровня окисленных веществ происходит активация ферментативной составляющей защитной системы. Компоненты системы антиоксидантной защиты  многочисленны и разнообразны. В последние годы становится все более популярной гипотеза, согласно которой причиной окислительного стресса является не столько интенсивная продукция активных форм кислорода , сколько нарушение пространственно-временного баланса между их генерацией и удалением. Предполагается, что основная причина возникновения окислительного стресса может заключаться в "отказе" защитных систем. Под "антиоксидантами" изначально понимали вещества, которые ингибировали процессы цепного свободнорадикального окисления (СРО). Со временем термины "антиоксидантная система" и "антиоксиданты" стали использоваться значительно шире, особенно в биологической литературе . Так, под системой АО защиты стали подразумевать не только системы, элиминирующие АФК и предотвращающие их возникновение, но также системы детоксикации, которые устраняют соединения, поврежденные вследствие спонтанного окисления кислородом. Можно встретить и другое определение для АО. Антиоксиданты - это природные или синтетические соединения, замедляющие или предотвращающие окисление органических веществ К ним отнесли вещества, способные нейтрализовать свободные радикалы и уменьшать интенсивность СРО, а также те, которые оказывают протекторное действие в отношении биологических структур.

Целью проведения исследования было изучение влияния холодового стресса на изменение активности антиоксидантного фермента – каталазы в листьях растений томатов.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. получить клонально микроразмноженные растения томатов;
2. колонизировать растения томата ассоциативными микроорганизмами Pseudomonas aureofaciens BS1393 и Methylovorus mays, исследовать стабильность ассоциативной связи бактерий с растениями;
3. выявить изменение активности каталазы под влиянием холодового стресса в листьях растений;
4. оценить устойчивость колонизированных растений к действию холодового стресса.

Глава 1. Литературный обзор

2. Стресс растений. Механизмы  борьбы со стресоом.

2.1 Стресс и его виды.

 Теория стресса была сформулирована Гансом Селье (Hans Hugo Bruno Selye), канадским эндокринологом австро-венгерского происхождения. А сам термин стресс (от англ. stress- напряжение) был заимствован физиологами растений из медицины. Внешние факторы, вызывающие стресс, принято называть стрессорами, а стресс рассматривать как состояние организма, формирующееся в ответ на их воздействие. Лишь при определенных условиях реакция растения на стрессорные условия бывает патологической, обычно она имеет адаптивное значение. Выделяется три фазы реакции растения на стресс: первичная стрессовая реакция (тревога), адаптация (резистентность) и истощение. В первой фазе происходят серьезные отклонения в физиолого-биохимических процессах, растение проявляет как симптомы повреждения, так и защитные реакции, которые направлены на устранение повреждений. В случае, если стрессорное воздействие слишком велико, растение может погибнуть в этой фазе развития стресса. Если растение уцелело, наступает вторая фаза, в которой растение либо адаптируется к новым условиям, либо повреждения в нем усиливаются. Закономерностью является то, что при медленном развитии неблагоприятных условий растения к ним легче приспосабливаются. Когда фаза адаптации заканчивается, растения нормально вегетируют (но при пониженном общем уровне процессов). В третьей фазе, фазе повреждения, в растении подавляются основные жизнеобеспечивающие реакции, и если стресс превышает пороговое значение, растение погибает. При прекращении действия стресс-факторов и нормализации внешних условий включаются процессы репарации, восстановления.

Выделяют три основные группы факторов, вызывающих стресс у растений:

1) физические, к которым относят недостаточную или избыточную влажность, освещенность, температуру, радиоактивное излучение, травмирующие механические воздействия;

2) химические: ими являются различные соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы);

3) биологические, к которым относят возбудителей болезней, вредителей, а также другие растения, если с ними приходится конкурировать.

2.2  Виды устойчивости растений  к стрессу

Различные виды растений обеспечивают себе устойчивость и выживание в  неблагоприятных условиях тремя основными способами.

Во-первых, с помощью механизмов, которые позволяют им избежать неблагоприятных  условий. Так эфемеры впадают в длительное состояние покоя, вегетируя лишь в краткий влажный и теплый период.

Во-вторых, с помощью специальных  структурных приспособлений (к ним  относятся мелколистность и даже отсутствие листьев, воскообразный  слой на поверхности листьев, их густое опушение и погруженность устьиц, наличие сочных листьев и стеблей, сохраняющих резервы воды), с помощью особенностей анатомического строения (кутикул, корки, механических тканей и т. д.) и с помощью специальных органов защиты (жгучих волосков, колючек). Транспирирующие органы - листья растений, отличаются значительной пластичностью. В зависимости от условий произрастания в их строении наблюдаются значительные отличия. Даже листья одного растения при разном водоснабжении и освещении имеют различия в строении. Установлены определенные закономерности в строении листьев в зависимости от расположения их на растении: у листьев верхнего яруса наблюдаются изменения в сторону усиления ксероморфизма, т.е. происходит образование структур, повышающих засухоустойчивость этих листьев. Листья, расположенные в верхней части стебля, всегда отличаются от нижних, а именно: чем выше расположен лист на стебле, тем меньше размеры его клеток, большее количество устьиц и меньше их размеры, большее количество волосков на единицу поверхности, гуще сеть проводящих пучков. С определенной анатомической структурой связаны и физиологические особенности, а именно: верхние листья отличаются более интенсивной транспирацией. Концентрация сока в верхних листьях также более высокая, в связи с чем может происходить оттягивание воды верхними листьями от нижних, засыхание и отмирание нижних листьев. Отличительные особенности в структуре листьев верхнего яруса объясняются тем, что они развиваются в условиях несколько затрудненного водоснабжения.

В-третьих, реакции растения на изменившиеся условия среды обязательно связаны с изменением его физиологических и биохимических процессов. Эти процессы сложны и часто взаимозависимы. Важнейшей реакцией клеток на действие стрессоров является синтез особых белков. Стрессовые белки синтезируются в растениях в ответ на различные воздействия: повышенные и пониженные температуры, обезвоживание, высокие концентрации солей, действие тяжелых металлов, вредителей, а также при ранениях и ультрафиолетовой радиации. В настоящее время обнаружено, что при каждом из этих стрессов синтезируются как общие, так и специальные для каждого из них белки. Выяснилось, что уже через 15 мин после начала воздействия стресс-фактора (например, теплового) в клетках обнаруживаются стрессовые белки. Стрессовые белки разнообразны и образуют группы высокомолекулярных и низкомолекулярных белков. Защитная роль стрессовых белков в растении подтверждается фактами гибели клетки при введении ингибиторов (блокираторов) синтеза белка в период действия стрессора.

Важнейшей реакцией на неблагоприятные  воздействия является также изменение  свойств мембран, что связано  с перестройками в их структуре. Увеличивается вязкость цитоплазмы, наблюдается торможение деления  и роста клеток. Вырабатывается вещество пролин, осмотически активное низкомолекулярное вещество, образующее гидрофильные коллоиды, удерживающее воду и защищающее растительные белки от разрушения (при засухе, избытке солей, низкой или высокой температурах).

В ситуации стресса растения вырабатывают также специфические сахара, полиамины, беатины, токсины.

На состояние стресса реагирует  гормональная система растений: возрастает количество абсцизовой кислоты, этилена, жасмоновой кислоты, изменяется соотношение фитогормонов. Увеличивается выработка гормонов, приводящих к торможению роста растения и вхождение его в состояние покоя.

Отмечено, что клетки стрессоустойчивых  растений в процессе адаптации быстрее  перестраивают направление и  скорость метаболических реакций так, чтобы быстрее вырабатывать необходимые  вещества. Здоровые растения, в отличие  от больных, также легче переносят  стресс и адаптируются к изменившимся условиям.

2.3 Окислительный стресс  у растений

Появление молекулярного кислорода, в основном, как побочного продукта фотосинтеза явилось значительным событием в биологической эволюции и имело два важных следствия. Во-первых, в клетке были сформированы механизмы утилизации этого вещества путем использования его в качестве универсального акцептора электронов при окислении широкого круга субстратов. Во-вторых, как эукариотные, так и прокариотные организмы, постоянно сталкиваясь с кислородом в своей жизнедеятельности, оказались перед необходимостью выработать физиологические и молекулярные механизмы, препятствующие его токсичности (Bert, 1943; Мерзляк, 1999). Все организмы, которые используют кислород и, следовательно, содержат его и различные продукты восстановления, должны защитить себя от токсичности кислорода.

В своем основном состоянии О₂  сравнительно неактивен, но он способен формировать потенциально летальные реактивные возбужденные состояния, такие как свободные радикалы (СР) и их производные.

Термин «активированный кислород» (или «активные формы кислорода» (АФК) обозначает совокупность коротко  живущих, взаимопревращающихся и относительно реакционноспособных форм кислорода, возникающих в результате его  электронного возбуждения или окислительно-восстановительных  превращений.

Особенность АФК – их высокая  реакционная способность. Этим они  отличаются от молекулярного кислорода, который не вступает в прямые неферментативные реакции. К АФК относятся гидроксильный (·ОН), алкоксильный (RO·), пероксильный (ROO·) радикалы, супероксидный анион-радикал (·О₂ ^-), а также синглетный кислород (¹О₂), который по сути не является свободным радикалом. Из других АФК важную роль играют перекиси и радикалы липидов, а также оксиды азота. Пять возможных видов АФК образуются в результате последовательного присоединения электронов к молекуле кислорода :

Для образования АФК кислород должен быть активирован. Такая активация  возникает двумя путями. Первый –  фотодинамический, который заканчивается образованием синглетного кислорода. Второй сопровождается формированием супероксид-аниона и гидроксильного радикала. Процесс радикалообразования усиливается в присутствии металлов переменной валентности, таких как железо, медь, и специфических ферментов – монооксигеназ и других оксидаз (Sahnoun et al., 1997).

Степень реактивности разных форм кислорода  различна и зависит не только от химической природы радикала, но и от характера среды. Наиболее активной формой считают гидроксильный радикал, за ним следует протонизированная форма супероксиданиона (·ОН), который при физиологических значениях рН образуется в ограниченных количествах. Супероксид-анион малоактивен в водных растворах, но эффективно окисляет липидные слои клеточных мембран. Вероятно, что синглетный кислород может формироваться в процессе расщепления перекиси водорода пероксидазой. Из всех радикалов АФК перекись водорода является самой устойчивой в растворах молекулой. Она образуется при восстановлении супероксид-аниона в реакции дисмутации и может возникать не только радикальным, но и безрадикальным путем. Все АФК могут претерпевать взаимные превращения, которые зависят от присутствия металла с переменной валентностью или от конкретного фермента. АФК также могут вызывать образование вторичных реактивных продуктов, таких как липидные пероксиды.

Около 1% кислорода, присутствующего  в растении, превращается в активированный кислород в различных субклеточных локусах: хлоропластах, митохондриях, плазмалемме, микросомах, пероксисомах, глиоксисомах, клеточной стенке. Существуют многочисленные механизмы и сигнальные трансдукционные пути, ведущие к генерации. Образование АФК можно рассматривать как побочную реакцию, сопровождающую процессы переноса электронов по электронтранспортным цепям (ЭТЦ) митохондрий, хлоропластов и эндоплазматического ретикулума, когда О₂ функционирует как альтернативный акцептор электронов. Другим источником АФК служат специальные ферменты, окисляющие определенные субстраты посредством О₂, или неферментативные реакции. Кислород может активироваться фотодинамическими реакциями. Многие биологические компоненты являются эффективными фотосенсибилизаторами – молекулами, способными поглощать свет и индуцировать химические реакции с образованием АФК.

2.3 Система защиты растений от АФК

Поскольку активированные формы кислород высоко токсичны, они непрерывно находятся  под контролем организма. Известны два различных механизма защиты: уменьшение образования АФК и  функционирование антиоксидантной  системы.