Отчет по практике по химии

     Чашечный  метод широко используется для определения  количества жизнеспособных микроорганизмов  в почве и других естественных субстратах. Он позволяет учесть не только численность микроорганизмов  в субстрате, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний. Следует помнить, что результаты определения этим способом численности микроорганизмов, образующих щепочки или другие скопления  клеток, будут всегда несколько занижены. 

     Приготовление разведений

     Разведение  делают в стерильном 0,5%-ном вводом растворе NaCl. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют его при 1 атм. В ходе одного опыта пользуется постоянным коэффициентом разведения, так как в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого стерильный раствор NaCl разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведении тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате. Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный.

     Посев на агаризованные среды в Чашки Петри

     В стерильные чашки Петри разливают  расплавленную на кипящей водяной  бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2-3 суток при 30⁰ крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки её стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Посев делают из определённых разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определённый объем (обычно 0,05, 0,1 или 0,2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем эти же шпателям проводят по всей поверхности во второй чашке. Куда посевной материал не вносили. Из каждого разведения делают, таким образом, 4-6 параллельных высевов. Для параллельных рассевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют новую стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов. 
 

     Подсчет выросших колоний

     Подсчет выросших колоний проводят через  определенное время после посева, которое зависит от скорости роста  выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и при данной температуре. Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из этого  разведения. Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют или используют полуавтоматические счётчики. Лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчётов количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300.

 Определение  количества микроорганизмов в  1 мл исходного субстрата. Наиболее  вероятно количество микроорганизмов,  содержащееся в 1 мл исходного  субстрата, при уровне достоверности  95% (Р_0,95) вычисляют по формуле 
 

      - среднее число  колоний, выросшее  при высеве из  данного разведения;

       - среднее квадратичное  отклонение;

     2 – t-критерий при Р_0,95;

     К- разведение из которого проведен высев;

     V- объём суспензии, взятый для посева, мл;

     общее количество подсчитанных колоний при высеве данного разведения;

     n- число повторностей.

     Если  уровень достоверности 99% , то t-критерий соответствует 2,7, поэтому формула для Р_0,95 имеет следующий вид:

     ;

     Статистическая  обработка результатов возможна только при минимальной технической  ошибке. Чашечный метод требует большой  чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно  оберегать пипетки и среды  от заражения посторонними микроорганизмами, так как каждая случайно попавшая клетка может завысить число микроорганизмов в исследуемой суспензии. Поэтому приготовление разведений и высевы лучше проводить в боксе.