Кинетическая классификация химических реакций. Ферментативный катализ. Особенности действия ферментов

При протекании обычных химических реакций важно, какими частями происходит столкновение реагирующих молекул. То есть, молекулы при столкновении должны быть соответствующим образом  ориентированы друг относительно друга. В реакционном центре фермента при  координации молекулы субстрата  и образовании фермент-субстратного комплекса происходит четкая ориентация реагирующих молекул за счет взаимодействия с функциональными группами реакционного центра. Это приводит к ускорению  реакций примерно на три порядка.

Под полифункциональностью реакционного центра фермента понимают одновременное  или согласованное воздействие  функциональных групп, входящих в состав реакционного центра, на молекулу субстрата. При этом происходит не только фиксация превращающейся молекулы в строго определенном положении (см. предыдущий пункт), но и  изменение характеристик самой  молекулы: растягивание связей, изменение  валентных углов. Эти изменения  приводят к повышению реакционной  способности субстратов, т.е., к их активации и ускорению их превращения.

Кинетика ферментативного катализа имеет некоторые особенности. Способность  ферментов специфически связывать  свои субстраты обусловливает важнейшую  особенность катализируемых ими  реакций: они начинаются с образования  фермент-субстратного комплекса. Связывание субстратов ограничивает их подвижность, сближает и ориентирует их относительно друг друга оптимальным образом  для осуществления реакции; уменьшение степеней свободы поступательного  и вращательного движения приводит к снижению энтропии. Важным следствием сближения и взаимной ориентации реагирующих групп субстратов, с одной стороны, и функциональных групп фермента, с другой, является то, что катализ становится внутримолекулярным. Это существенно увеличивает его эффективность, так как продуктивные столкновения между молекулами в растворе относительно редки.

По Л. Михаэлису и М. Ментен образование  фермент-субстратного комплекса осуществляется в результате сравнительно быстрой  обратимой стадии:

k₁

E + S         ES

k_-1

Затем комплекс более медленно распадается  с образованием продукта и высвобождением фермента:

k₂

ES        E + P

k_-2

Вторая стадия реакции является лимитирующей. Общая скорость реакции  пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса. В начальный период реакции  концентрация продукта пренебрежимо мала, и вторую стадию можно считать  необратимой. В таком случае начальная  скорость ферментативной реакции выражается уравнением:

R_o = k₂[ES]

Приняв, что [E_o] – общая концентрация фермента, а ([E_o] - [ES]) соответствует концентрации свободного фермента, а также что [S] >> [E_o], можно получить выражение для [ES]:

[ES] = ([E_o]∙ [S]/{ [S] + (k₂ + k_-1)/k₁}

Отношение (k₂ + k_-1)/k₁ называется константой Михаэлиса ( К_М); с учетом этого концент-

рация фермент-субстратного комплекса  и начальная скорость могут быть описаны уравне-ниями:

[ES] = [E_o]∙ [S]/ (К_М + [S])

R_o = k₂[ES] = k₂[E_o]∙ [S]/ (К_М + [S])

Последнее уравнение называют уравнением Михаэлиса-Ментен. Необходимо отметить, что величина К_М совпадает с термодинамической константой диссоциации фермент-субстратного комплекса только в случае квазиравновесия первой стадии и лимитирования процесса второй стадией. Во всех остальных случаях К_М является сложным комплексом констант скорости стадий ферментативного процесса.

Рассмотрим механизм функционирования ферментативного катализатора на примере  гидролитического фермента химотрипсина.

Химотрипсин – фермент поджелудочной  железы, функция которого в организме  заключается в расщеплении белков пищи, т.е. пептидной связи. Кроме  этого химотрипсин может катализировать гидролиз сложных эфиров и некоторые  другие реакции. Брутто формула химотрипсина, включающего 241 остаток аминокислот, не несет информации о строении: С₁₁₀₅H₁₇₃₂O₃₄₄N₃₀₀S₁₂, также как перечисление количества аминокислотных остатков: аланин₂₂ аргинин₃ аспарагиновая кислота₈ аспарагин₁₄ глутаминовая кислота₃  глутамин₁₀ глицин₂₄ гистидин₂ изолейцин₁₀ лейцин₁₉ лизин₁₄ метионин₂ полуцистин₁₀ пролин₉ серин₂₈ треонин₂₂ триптофан₈ тирозин₄ валин₂₃ фенилаланин₆. Перечисленные аминокислотные остатки соединены в полипептидную цепь в определенной последовательности (первичная структура). Отдельные части полипептидной цепи за счет образования дополнительных связей (см.выше) скручиваются в α-спирали, β-тяжи и петли (вторичная структура). Перечисленные элементы вторичной структуры за счет дополнительных взаимодействий сворачиваются в два домена, в месте соприкосновения которых возникает активный центр фермента, включающий остаток серина (Х – -СН₂ОН ), аспарагиновой кислоты ( Х - -СН₂СОО^-), гистидина.

 

 

 

 

 

Механизм реакции гидролиза  сложного эфира показан на схеме. 2. При подходе субстрата к активному  центру фермента неполярная гидрофобная  часть субстрата взаимодействует  с гидрофобной частью активного  центра, протон от серина переходит  на азот гистидина, а протон от второго  азота гистидина смещается к  аниону остатка аспарагиновой кислоты. Образовавшийся из гидроксильной группы серина сильный нуклеофил - -О атакует  электрофильный углерод субстрата, в то время как нуклеофильная  часть субстрата взаимодействует  с протоном, связанным с гистидином. В результате этих взаимодействий образуется фермент-субстратный комплекс. На следующей  стадии рвется связь С-Х в субстрате, уходит молекула НХ, а ее место в  активном центре занимает молекула воды. Протон от остатка аспарагиновой  кислоты возвращается к второму  азоту гистидина. Затем рвется предварительно активированная связь О-Н в молекуле воды (протон связывается с первым азотом гистидина, а гидроксил –  с углеродом бывшего субстрата). Протон от второго азота гистидина опять возвращается к остатку аспарагиновой кислоты. И наконец выделяется кислота, место которой занимает новый субстрат или активный центр возвращается в исходное состояние.

 

Механизм действия ферментов

Структура и функции ферментов, а также механизм их действия почти  ежегодно подробно обсуждаются на многих международных симпозиумах и  конгрессах. Важное место отводится  рассмотрению структуры всей молекулы фермента и ее активных центров, молекулярному  механизму действия различных типов  ферментов, общей теории энзиматического  катализа. Тем не менее, до сих пор  нет полной ясности по двум кардинальным проблемам энзимологии: чем вызваны  специфичность действия и высокая  каталитическая эффективность ферментов?

До установления химической природы  ферментов гипотезы о механизме  их действия опирались на исследования кинетики и модельные опыты химического  гомогенного катализа. Повышение  скорости химических реакций под  действием ферментов объясняли  следующим:

а) активированием субстрата в результате образования адсорбционных или  молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов;

б) цепным механизмом реакций с  участием радикалов или возбужденных молекул. Оказалось, что цепные механизмы  реакции не играют существенной роли в биологическом катализе.

После установления химической природы  ферментов подтвердилось представление, выдвинутое более 80 лет назад В. Анри, Л. Михаэлисом и М. Ментен, о том, что  при энзиматическом катализе фермент  Е соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом S, образуя нестойкий  промежуточный фермент-субстратный  комплекс ES, который в конце реакции  распадается с освобождением  фермента и продуктов реакции  Р. Благодаря высокому сродству связывания и образованию ES-комплекса резко  возрастает число молекул субстрата, вступающих в реакции. Эти представления  легли в основу теории «ключа-замка» Э. Фишера, которую иногда называют теорией «жесткой матрицы». Таким  образом, жесткая структура активного  центра оказывается комплементарной  молекулярной структуре субстрата, обеспечивая тем самым высокую  специфичность фермента.

Л. Михаэлис не только постулировал образование  промежуточного фермент-субстратного ES-комплекса, но и рассчитал влияние  концентрации субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают  несколько стадий: присоединение  молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий отделение конечных продуктов реакции от фермента. Это можно схематически проиллюстрировать следующими примерами:

 

 

В реакциях анаболизма, например А + В  —> АВ, фермент может соединяться  как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами:

 

 

В реакциях катаболизма, например АВ —> А + В:

 

 

На рис. 4.7 представлена схема образования  промежуточного фермент-субстратного комплекса. Если фермент в активном центре содержит кофермент, то предполагается образование тройного комплекса (рис. 4.8).

 

Рисунок 4.7 – Образование нестойкого фермент-субстратного комплекса согласно теории Э. Фишера «ключ-замок»

 

 

Рисунок 4.8 – Функция кофермента (по А. Кантарову и Б. Шепартцу)

 

Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, поэтому долгое время не удавалось  показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования  фермент-субстратного комплекса были получены в лабораториях Д. Кейлина  и Б. Чанса. В настоящее время  экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и  статической механики химических реакций  позволяют определить для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические  показатели, в частности константы  диссоциации промежуточных фермент-субстратных  комплексов, константы скорости и  равновесия их образования.

В образовании фермент-субстратных  комплексов участвуют водородные связи, электростатические и гидрофобные  взаимодействия, а в ряде случаев  также ковалентные, координационные  связи (рис. 4.9). Информация о природе  связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии.

 

Рисунок 4.9 – Образование не-ковалентных  связей между ферментом и субстратом (схема)

 

Для каталитической активности фермента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие  участки α-спиралей чередуются с  гибкими, эластичными линейными  отрезками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим измененям придается большое  значение в некоторых теориях  ферментативного катализа. Так, в  противоположность модели Э. Фишера «ключ-замок» Д. Кошлендом была разработана  теория «индуцированного соответствия», допускающая высокую конформационную  лабильность молекулы белка-фермента и гибкость, и подвижность активного  центра. Эта теория была основана на весьма убедительных экспериментах, свидетельствующих  о том, что субстрат индуцирует конформационные  изменения молекулы фермента таким  образом, что активный центр принимает  необходимую для связывания субстрата  пространственную ориентацию. Иными  словами, фермент только в присутствии (точнее, в момент присоединения) субстрата  будет находиться в активной (напряженной) Т-форме в отличие от неактивной R-формы (рис. 4.10).

 

Рисунок 4.10 – Изменения структуры  активного центра фермента, вызванные  субстратом, согласно модели «индуцированного соответствия» Д. Кошленда (А, В, С  – функциональные группы активного  центра; 1 – активный комплекс; 2 –  неактивный комплекс)

 

На рис. 4.10 видно, что присоединение  субстрата S к ферменту Е, вызывая  соответствующие изменения конформации  активного центра, в одних случаях  приводит к образованию активного  комплекса, в других – неактивного  комплекса вследствие нарушения  пространственного расположения функциональных групп активного центра в промежуточном  комплексе. Получены экспериментальные  доказательства нового положения о  том, что постулированное Д. Кошлендом  «индуцированное соответствие»  субстрата и фермента создается  не обязательно изменениями конформации  белковой молекулы, но также геометрической и электронно-топографической перестройкой молекулы субстрата.

В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соответствие между ферментом и субстратом, а также термодинамические и  каталитические преимущества подобного  соответствия. Гипотеза «индуцированного соответствия» предполагает существование  между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической комплементарности, но и электростатического  соответствия, обусловленного спариванием  противоположно заряженных групп субстрата  и активного центра фермента. Точное соответствие обеспечивает образование  эффективного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации. Энергией активации называется энергия, необходимая  для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при  данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается, несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне (рис. 4.11).

На рисунке видно, что ферментативная реакция имеет более низкую энергию  активации. Следует отметить, что  как катализируемая ферментом, так  и не катализируемая им реакция независимо от ее пути имеет одинаковую величину стандартного изменения свободной  энергии (ΔG). Действуя на скорость реакции, ферменты не изменяют равновесия между  прямой и обратной реакциями, как  и не влияют на величину свободной  энергии реакции; они лишь ускоряют наступление равновесия химической реакции.