Ферменты бета-галактозидазы

Содержание: 
 

  Введение……………………………………………………………………………..2

1. Характеристика препарата……………………………………………………...3
1. Показатели………………………………………………………………………3
2. Катализируемая реакция……………………………………………………….3
3. Применение препарата…………………………………………………………4
2. Технология получения препарата…………………………………………….6
1. Продуцент фермента…………………………………………………………...6
2. Источники углерода……………………………………………………………6
3. Источники азота………………………………………………………………...7
4. Способы культивирования…………………………………………………….9
5. Выделение……………………………………………………………………..11
6. Процессуально-технологическая схема……………………………………..12

  Заключение………………………………………………………………………...13

  Список  литературы………………………………………………………………..14 

 

  

Введение.

     Производство  ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции, которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможно осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

     Применение  ферментных препаратов различной степени  очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать  кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить  качество косметических препаратов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т.д.

     Производство  ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и развиваться.

 

  

1. Характеристика  препарата

1.1 Показатели (нормы)

     Ферментный  препарат β-галактозидаза дрожжевая выпускается в соответствии с требованиями ТУ.

     Данный препарат представляет порошок белого цвета, с влажностью около 10%. Активность составляет до 500-100 ед/г. Практически нейтральный рН составляет интервал 6,8-7.

     Упаковывают ферменты в полиэтиленовые мешки, а затем в бумажные пакеты массой от 2 до 2,5 кг. Срок хранения 12 месяцев со дня изготовления.

     При истечении срока  хранения препарат можно использовать две недели, а затем утилизировать. Хранения производят в сухом защищённом от света месте при температуре от -40 до 25 °С.

2. Катализируемая реакция

 

механизм  гидролиза лактозы 

1.3 Применение препарата

       Препараты β-галактозидазы прежде всего находят широкое применение в молочной промышленности и в тех отраслях, где возможно использовать отходы молокоперерабатывающей промышленности, содержащие дисахарид лактозу. Лактоза является очень ценным углеводом, но сахар этот плохо растворим, несладкий, не усваивается часто животными организмами, не сбраживается дрожжами. Если с помощью β -галактозидазы осуществить его расщепление до галактозы и глюкозы, то эта смесь уже имеет сладкий вкус, хорошо растворяется в воде, глюкоза усваивается как животными, так и микроорганизмами. Обработка молока и молочных изделий препаратами β-галактозидазы позволяет обеспечить часть населения, страдающего лактазной недостаточностью, молочными продуктами, почти не содержащими лактозу.

       Обработка молока ферментом при концентрировании, особенно при его последующем хранении при низких температурах, позволяет повысить стабильность продукта при регенерации. Гидролиз около 20—30 % лактозы молока при приготовлении мороженого позволяет предотвратить явления его кристаллизации и уменьшить на 1—2 % добавку сахарозы. Использование β-галактозндазы при приготовлении кисломолочных продуктов способствует более быстрому развитию молочнокислых микроорганизмов, что позволяет ускорить технологические процессы.

       Использование β-галактозидазы делает перспективным утилизацию различных молочных отходов, особенно молочной сыворотки, во многих отраслях, например в хлебопечении, в кондитерской промышленности, при производстве мороженого, в качестве компонента питательных сред при получении белковых обогатителей кормов или различных биологически активных веществ, в кормопроизводстве, в медицинской промышленности, медицине и т. д. Большое значение придается β-галактозидазе при ее использовании в аналитических целях и для диагностики ряда заболеваний.

       В настоящее время публикуется много работ по применению β -галактозидазы в иммобилизованном виде, особенно при обработке жидких отходов молочной промышленности. В нашей стране ведется только освоение технологии получения препаратов микробной β-галактозидазы и поэтому пока область применения несколько уже, чем за рубежом. Но даже такой далеко не полный перечень областей применения β-галактозидазы убедительно свидетельствует о том, что эти препараты можно отнести к промышленно важным. 
 
 

 

2. Технология получения  препарата
1. Продуцент фермента

     Наиболее перспективным источником липаз являются микроорганизмы, так как животное и растительное сырье не может удовлетворить растущую потребность в этих препаратах. Липазы образуют очень многие микроорганизмы. Бактерии, как правило, накапливают внутриклеточную липазу, а актиномицеты, грибы и дрожжи — преимущественно внеклеточную.

     Место локализации липазы, образуемой микроорганизмами, часто зависит от физиологического состояния культуры. Было показано, что для культуры Rhizopus oryzae характерно образование как внеклеточной, так и внутриклеточной липазы. В процессе роста микроорганизма уровень накопления фермента в фильтрате культуральной жидкости и в мицелии менялся.

     При изучении локализации липазы R. oryzae был использован метод дифференциального центрифугирования. Было установлено, что липазная активность в основном связана с фракцией супернатанта для культуры, находящейся в стационарной фазе развития.

     Для начальных этапов роста гриба  картина накопления фермента обратная, основная часть липазы локализуется в клетке.

2. Источники углерода

    Основным источником углерода для большинства продуцентов является лактоза, содержание которой в среде может быть от 2 до 20 %. Часто в качестве источника лактозы используют молочную сыворотку — отход при получении сыра, творога, казеина. Она содержит 4—4,8 % лактозы, 0,5—1 % белка, 0,05—0,4 % жира и 0,5—0,7 % золы. В составе сред она может быть использована в жидком или сухом виде после обработки нагреванием и депротеинизирования.

    Оптимальная концентрация лактозы в среде зависит от продуцента. Чем сильнее подвержен микроорганизм катаболитиной репрессии, тем ниже должна быть концентрация лактозы. В составах некоторых сред помимо лактозы упоминаются ксилоза, галактоза, арабиноза, раффиноза, сахароза. Влияние источников углерода на биосинтез β -галактозидазы можно продемонстрировать на культуре гриба P. canescens в табл. 1.

    Таблица1.

       Из таблицы видно, что для этого продуцента наибольший биосинтез отмечается на ксилане, пектине и молочной кислоте, а на галактозе и лактозе отмечается хороший рост, но небольшое образование β -галактозидазы.

       Анализ используемых в производстве сред показывает, что чаще всего в среды включают в качестве источника углерода различные отходы или дешевые природные субстраты, такие, как пшеничные и рисовые отруби, кукурузный и картофельный крахмал, декстрины, гидрол, меласса, кукурузная кочерыжка, обезжиренная соевая мука, сорбитол, свекловичный жом, молочная сыворотка, мука хлопковых семян и т. д.

3. Источники азота

       Не меньшее значение, чем источник углерода, имеет в составе среды азотистое питание.

       Часто в качестве источника азота используют аммонийные соли. Но обычно для обеспечения высокого синтеза фермента минерального азота бывает недостаточно и потому в состав сред вводятся в небольших количествах различные органические добавки (дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, экстракт солодовых ростков, пептон, гидролизаты казеина, микробные массы, триптон и т. д.). Благотворное влияние этих добавок на рост культур и биосинтез фермента, вероятно, связано не только с органической формой азота, но и с тем, что они богаты ростовыми веществами и биостимуляторами.

       Дать общие рекомендации по составу среды и соотношению ее компонентов не представляется возможным. В этом случае, как и для других ферментных препаратов, необходимо индивидуально для каждого продуцента экспериментально определять оптимальные источники азота, углерода и отношение в среде углерода к азоту. Так для P. canescens следует отметить, что при оптимальном уровне азота в среде 0,15 % наибольший биосинтез β-галактозидазы отмечался при отношении С : N от 4 до 8. 

 

2.4 Способы культивирования

       Существенное влияние на биосинтез микроорганизмами β -галактозидазы оказывают условия культивирования продуцентов. Очень большое влияние оказывают рН среды и его изменение в процессе роста культуры (рис. 1). Из рисунка видно, что максимальный синтез β -галактозидазы наблюдается только при рН от 3 до 4, и если его поддерживать на оптимальном уровне, то биосинтетическую способность продуцента по этому ферменту можно повысить в 1,5—2,5 раза. Данные других авторов также подтверждают эту закономерность. Существенное влияние на биосинтез микроорганизмами β-галактозидазы оказывают температура культивирования, интенсивность аэрации и посевной материал.

       

       Рис. 1. Влияние исходной величины рН среды на биосинтез микроскопическими грибами β -галактозидазы:

       1 — биомасса, г/100 мл; 2 — β -галактозидазная активность в культуральной жидкости, ед./100 мл; 3 — β -галактозидазная активность в мицелии, выросшем в 100 мл среды

       Большинство дрожжевых и грибных продуцентов β -галактозидазы относится к мезофильным организмам, оптимально развивающимся при температуре от 25 до 35 °С. Исключение составляют некоторые штаммы рода Mucor (45 °С) и психрофильные дрожжи Trametes versicolor и Tyromyces albellus с оптимальной температурой роста 20 °С. Бактериальные продуценты β –галактозидазы, за исключением Е. coli, представлены в основном термофилами с температурой роста от 45 до 65—70 °С.

       За исключением некоторых бактериальных штаммов, например рода Citrobacter, продуценты β -галактозидазы являются аэробными микроорганизмами и нуждаются в аэрации. Степень аэрации культур имеет большое значение, о чем свидетельствуют работы А. С. Тихомировой и других исследователей. Было установлено, что нарушение конструктивных процессов в дрожжах при лимитации роста культуры по воздуху приводит к усилению интенсивности биосинтеза β -галактозидазы. Но в то же время для грибных культур возрастание степени аэрации сопровождалось всегда повышением β -галактозидазной биосинтетической способности продуцентов.

       Вид посевного материала, его качество и количество во многом определяют рост культуры и процесс биосинтеза фермента. Выбор вида посевного материала зависит от микроорганизма и устанавливается экспериментальным путем. Влияние посевного материала можно продемонстрировать на образовании β-галактозидазы культурой P. canescens (рис. 2.) Очевидно, что микроорганизмы различных таксономических групп способны к индуцированному и конститутивному биосинтезу β -галактозидазы. Она может накапливаться внутри клетки илн секретироваться во внешнюю среду.

       

       Рис. 2.60. Зависимость образования β -галактозидазы P. canescens от вида посевного материала:

       1. 2 — вегетативный соответственно в количестве 1 и 10%, 3, 4—конидиальный соответственно в количестве 5 • 10^е и 1 • 10» 

       Известно, что внеклеточные β -галактозидазы являются гликопротеидами, а внутриклеточные практически не содержат углеводного компонента. Присоединение углевода к ферменту, вероятно, соответствует определенной фазе его роста и совпадает с моментом выхода фермента из клетки в процессе его прохождения через клеточную стенку. Считается, что первый остаток углевода присоединяется к ферменту, когда последний начинает сходить с рибосомы. Галактоза, маиноза, сиаловые кислоты присоединяются к белку при прохождении полипептида через клапаны в мембранах. Длина и состав углеродного фрагмента могут варьировать. Полипептид проходит мембраны в развернутом состоянии, а при выходе происходит молекулярная перестройка, при которой углеводы способствуют удерживанию фермента в трехмерном состоянии и увеличивают его стабильность. Это обстоятельство очень важно учитывать при производстве β-галактозидазных препаратов. Образование β-галактозидазы и ее выход из клетки зависят от многих факторов, и для определения оптимальных параметров процесса выращивания продуцентов в каждом отдельном случае требуется тщательное изучение закономерностей ее биосинтеза.