Виникнення та реєстрація права інтелектуальної власності на спосіб культивування мікробіологічного механізму Ашерсонії (гриби роду Ascher

     ТП—З.а.14. Контроль культури. Протягом культивування (5—7-ма доба) здійснюють огляд колб на чистоту культури. Забруднення визначають візуально при появі слизистих колоній бактерій. Забруднені колби вибраковують і передають на стерилізацію. Контроль за титром потребує, щоб вихід спор гриба вирощеного у 0,5 л колбі становив 2—7 х 1010.

     ТП—З.б. Масове культивування гриба на рідкому живильному середовищі.

     ТП—3.6.1. Приготування живильного середовища. Як у ТП—2.6.5.

     ТП—3.6.2. Стерилізація. Середовище стерилізують в автоклаві за тиску 0,1 МПа протягом 1 години.

     ТП—З.б.3. Вирощування гриба. Масово культивують гриба як у ферментері, так і в колбах.

     ТП—З.б.З.а. Вирощування гриба  у ферментері.

     ТП—З.б.З.а.1. Підготовка ферментера до роботи. Як у ТП— З.а.1 розділу 4.1.1.5.

     ТП—З.б.З.а.2. Стерилізація ферментера. Як у ТП—З.а.2 розділу 4.1.1.5.

     ТП—З.б.З.а.З. Завантаження живильного середовища в ферментер. Як у ТП—З.а.4 розділу 4.1.1.5.

     ТП—З.б.З.а.4. Доведення рН. РН середовища 10% розчином ИаОН або НС1 доводять до значення 6,0.

     ТП—З.б.З.а.5. Визначення вмісту амінного азоту, цукрози і  фосфору в живильному середовищі. Як у ТП—2.а.8.

     ТП—З.б.З.а.6. Стерилізація середовища в ферментері. Як у ТП-З.а.8 розділу 4.1.1.5.

     ТП—З.б.З.а.7. Контроль середовища на стерильність. Як у ТП—З.а.9 розділу 4.1.1.5.

     ТП—З.б.З.а.8. Внесення маточної культури у ферментер. Маточну культуру вносять через завантажувальний люк у полум'ї факела. Кількість посівного матеріалу — 2% об'єму середовища в ферментері, що залежить від титру інокулюму.

     ТП—З.б.З.а.9. Встановлення параметрів культивування. Вирощування культури в ферментері здійснюють при такому режимі культивування: температура — 26°С, швидкість обертання постійно працюючої мішалки — 170 об./хв, витрата стерильного повітря на аерацію — 1 дм3/1 дм3 середовища за 1 хв. Встановлення заданих параметрів культивування та їх контроль здійснюють за допомогою відповідних пристроїв та контрольно—вимірювальних приладів, встановлених на ферментері.

     ТП—З.б.З.а. 10. Культивування  в ферментері. Під час культивування заданий температурний режим у ферментері підтримують подачею води в сорочку. Тривалість культивування — 36—60 год. Процес супроводжується піноутворенням. Для забезпечення нормального розвитку продуцента і запобігання викиду піни гасять її за періодичного (при потребі) введення в ферментер стерильного піногасника (пропінол Б-400 або соняшникова олія у кількості 0,05% об'єму середовища).

     ТП—З.а. 13. Відбір проб з ферментера і контроль виробничої культури. Як у ТП—З.а.13 розділу 4.1.1.5. Коли кількість сухої біомаси сягне 25 г/л, процес культивування закінчено.

     ТП—З.б.З.б. Вирощування гриба у колбах.

     ТП—З.б.3.6.1. Підготовка колб. Підготовка складається з миття колб, їх висушування, приготування ватно-марлевих серветок та паперових ковпачків, гумок для зав'язування, вміщення колб в автоклав.

     ТП——3.6.3.6.2. Стерилізація колб. Як у ТП—3.6.2 розділу 4.1.1.5.

     ТП—3.6.3.6.3. Завантаження живильного середовища у колби. Як у ТП— 3.6.6 розділу 4.1.1.5.

     ТП——3.6.3.6.4. Стерилізація колб в автоклаві. Як у ТП—3.6.8 розділу 4.1.1.5.

     ТП—3.6.3.6.5. Охолодження колб. Як у ТП—3.6.9 розділу 4.1.1.5.

     ТП——3.6.3.6.6. Контроль на стерильність. Як у ТП—1.9.

     ТП—З.б.З.б. 7. Засівання колб з середовищем. Засівають колби рідкою маточною культурою з розрахунку 10% обсягу живильного субстрату. Для цього в полум'ї факела в кожній колбі відкривають ватно-марлеву серветку і стерильною піпеткою вносять інокулюм.

     ТП—3.6.3.6.8. Збовтування колб. Рівномірного розподілу маточної культури в середовищі досягають збовтуванням колб.

     ТП—3.6.3.6.9. Підготовка дек та листового скла (п/е  плівки). Підготовка дек та скла (плівки) складається з їх миття та висушування.

     ТП——3.6.3.6.10. Стерилізація дек та листового скла (п/е плівки). Дека та скло стерилізують в автоклаві під тиском 0,18—0,2 МПа протягом 1 години. Поліетиленову плівку протирають 1% розчином хлораміну.

     Стадія  ТП—4. Культивування в деках.

     ТП—4.1. Зливання рідкої культури з ферментера (колб) у дека. Культуральну рідину передають трубопроводом у дека, підвищуючи тиск у ферментері до 0,1 МПа. Якщо культуру вирощували в колбах, то після зливання її накривають стерильним склом або поліетиленовою плівкою. Товщина шару культуральної рідини не повинна перевищувати 1,5 см.

     ТП—4.2. Розміщення дек та встановлення параметрів культивування. Дека встановлюють горизонтально на стелажах у термостатованій кімнаті за температури 24—28°С.

     ТП—4.3. Культивування. Культивування проводять в термостатованій кімнаті за температури 26°С протягом 25—28 діб до утворення білої плівки на поверхні культури. На останньому етапі культивації плівка вкривається краплями ексудату, що свідчить про завершення спороутворення.

     ТП—4.4. Забезпечення додаткового  освітлення. Як у ТП—З.а.13.

     ТП—4.5. Контроль культури. Як у ТП—З.а.14.

     ТП—4.6. Збирання плівок. Міцеліальну плівку гриба збирають з дек і розкладають на решітках, підплівкову рідину зливають з дек для подальшої стерилізації і зливання до каналізації.

     ТП—4.7. Висушування плівок. Плівку на решітках вміщують до сушильної камери спороносним боком догори. Висушують за температури 30°С протягом 24—48 годин. При висушуванні в течії теплого повітря тривалість процесу скорочується у 1,5—2 рази. Вміст вологи у висушеній плівці допускається не більше 10%.

     ТП—4.8. Подрібнення сухих  плівок. Подрібнюють плівки в кульовому або ротаційному млині (ТМЛ, ТРР-1) до дрібнодисперсного порошку (розмір часток — не більше 90 мкм).

     Стадія  ТП—5. Виготовлення препарату із заданим титром.

     ТП  —5.7. Визначення титру життєздатних спор. 1 грам подрібненої плівки розтирають у ступці в невеликій кількості води, отриману масу змивають 100 мл питної води, переносять у колбу і готують 3—5 послідовних розведень; отриману суспензію доводять водою до 1 л, після чого готують послідовні розведення: 1 мл суспензії піпеткою вливають у 9 мл води і ретельно збовтують, далі 1 мл суспензії попереднього розведення виливають у другу пробірку з 9 мл води. Краплю суспензії наносять на сітку камери Горяєва і підраховують спори під мікроскопом. Титр спор визначають за формулою Т = 25 х 104 а пп,

     де 25 х Ю4 — постійний коефіцієнт;

     а — середня кількість спор в  одному великому квадраті;

     пп  — розведення (п =10; п2=100; п3 =1000; п4 =10000 і т.д.)

     Визначають  титр у 2—3 повтореннях з наступним  усередненням, при потребі усереднюють титр наповнювачем (крохмалем), однак він повинен становити не менше 6 х Ю9 спор/г.

     ТП  —5.2 Фасування препарату. Препарат фасують в поліетиленові пакети по 1—2 кг.

     ТП  —5.5. Маркування препарату. Кожну одиницю  тари з препаратом маркують, зазначаючи виробника препарату, назву, титр, дату виготовлення, термін та умови зберігання.

     ТП—5.4. Зберігання препарату. Сухий препарат зберігають у холодильнику за температури 4—6°С протягом 6 місяців без втрати життєздатності спор. При тривалішому зберіганні (до року) слід провести аналіз життєздатності спор для коректування норми витрати препарату.

     Стадія  ТП—6. Визначення якості культури гриба і препарату.

     Для визначення норми витрати необхідно  враховувати титр: кількість спор в 1 мл суспензії культури гриба або  в 1 г сухого препарату.

     Для визначення норми витрати необхідно  враховувати титр: кількість спор в 1 мл суспензії культури гриба або  в 1 г сухого препарату.

     ТП—6.1. Визначення титру  спор у культурі гриба. З кожної партії відбирають 3% колб (звичайно це 3 з 100). З кожної колби спеціальним шпателем знімають спорово-міцеліальну масу і розтирають у фарфоровій ступці в невеликій кількості води. Ступку і поверхню середовища у колбі ретельно змивають питною водою і разом з гомогенною масою переносять до мірної колби або склянки. Отриману суспензію доводять водою до 1 л і готують два послідовних розведення. Краплю суспензії другого розведення наносять на сітку камери Горяєва, накривають покривним склом, яке ретельно притирають до появи райдужних кіл. Підрахунок спор ведуть під мікроскопом при окулярі х7, х10, і об'єктиві х 40. За такого збільшення в полі зору мікроскопа розміщується 1 великий (або 16 маленьких) квадрат камери. Спори підраховують в середньому ряді в 10 великих квадратах за винятком двох верхніх і нижніх. Титр спор в 1 мл похідної суспензії (1л) визначають за формулою, наведеною у ТП—5.1. Найчастіше підраховують спори в суспензії другого розведення, а у разі слабкого спороношення — першого. Для визначення загальної продуктивності спороношення в колбі розрахований титр множать на 1000. Таким чином визначають титр в кожній з 3% колб і розраховують середнє значення для даної партії.

     ТП—6.2. Визначення спор у  препараті. Як у ТП—5.1.

     ТП—6.3. Визначення титру  життєздатних спор у  препараті. У стерильному боксі на аналітичних вагах зважують 1 г сухого препарату. Одержану наважку переносять у стерильну фарфорову ступку і розтирають в невеликій кількості стерильної води. Гомогенну масу змивають 100 мл стерильної води (двічі), переносять у стерильну колбу і готують 9—10 послідовних розведень. З 4—5 останніх розведень стерильною піпеткою по 1 мл суспензії переносять в чашки Петрі з сусло-агаром. Колоподібними обертами чашки суспензію розподіляють по поверхні середовища. Засіяні чашки вміщують у термостат, встановлюючи температуру 26°С. На 5—7-му добу з'являються білі крапкові колонії. На кожній чашці олівцем пишуть дату, номер розведення і повторення. Підрахунок проводять в чашках Петрі того розведення, на яких виросло від 20 до 50 колоній. Для визначення титру життєздатних спор кількість колоній (з 3-х повторень) множать на розведення.

     Сусло-агарове  середовище розплавляють на водяній  бані, охолоджують до 40—50°С. Для пригнічення бактеріальної флори в охолоджений агар вносять розчин стрептоміцину, приготований в стерильній воді (50 мг стрептоміцину розчиняють у 100 мл стерильної води, з якої 1 мл вливають у 100 мл сусло-агару і ретельно збовтують). Живильне середовище у стерильній зоні полум'я спиртівки розливають в чашки Петрі, покриваючи дно (до 10 мл). Після його затвердіння наносять суспензію спор.

     Знешкодження  відходів та допоміжні роботи (обробка  кукурудзяного екстракту, стерилізація стиснутого повітря, дезінфекція технологічного обладнання і приміщень) проводять відповідно з розділом 4.1.1.5.

     4.1.3.4. Характеристика препарату Ашерсонія

     Ашерсонія — мікробіологічний інсектицидний  препарат, створений на основі гриба  Aschersonia.

     Препарат  застосовується на овочевих закритого  ґрунту проти тепличної білокрилки.

     Діючою  речовиною Ашерсонії є спори.

     Основні складові та опис зовнішнього вигляду і фізико-хімічних властивостей препарату наведено в таблицях 4.3.2—4.3.3.

4.3.2. Основні складові препарату Ашерсонія 

 

4.3.3. Зовнішній вигляд та фізико-хімічні властивості Ашерсонії 

 
 
 
 
 
 

     Пакування. Ашерсонію фасують у поліетиленові пакети по 1—2 кг. На пакети наклеюють маркувальну етикетку та інструкцію із застосування. Відхилення, що допускаються в масі одиниці упаковки — +1%.