Виникнення та реєстрація права інтелектуальної власності на спосіб культивування мікробіологічного механізму Ашерсонії (гриби роду Ascher

     ТП—1.16. Зберігання похідної культури. Похідну культуру зберігають у холодильнику при температурі 4—6°С у відкритих поліетиленових пакетах. Для запобігання швидкому підсиханню середовища ватні корки парафінують або закривають паперовими ковпачками. Пересівають культуру двічі на рік. Похідну культуру використовують для одержання маточного матеріалу за масового вирощування ашерсонії. Детальнішу інформацію щодо зберігання культури ашерсонії різних рас наведено у таблиці 4.1.3.1.

     4.1.3.1. Строки зберігання різних рас ашерсонії (за Бабчук и др., 1986)

 

     Стадія  ТП—2. Одержання маточної культури.

     Маточну культуру отримують за культивації  похідної культури на агаризованому або рідкому середовищі.

     ТП—2.а. Одержання маточної культури на агаризованому  середовищі.

     ТП—2.а.1. Підготовка колби. Колбу місткістю 1 л ретельно миють, висушують, готують ватно-марлеву серветку, гумку для зав'язування і вміщують в автоклав.

     ТП—2.а.2. Стерилізація. Колбу стерилізують в автоклаві під тиском 0,18—0,2 МПа протягом 1 години. Після закінчення стерилізації і зниження тиску в автоклаві до атмосферного колбу ставлять на охолодження до кімнатної температури.

     ТП—2.а.З. Стерилізація води. Мірним циліндром відмірюють 100 мл води і стерилізують її в автоклаві за тиску 0,1 МПа протягом 30 хв.

     ТП—2.а.4. Переливання води в колбу. Стерильну воду в кількості 100 мл переливають у стерильну колбу.

     ТП—2.а.5. Приготування живильного середовища для маточної культури. Як у ТП—1.3.

     ТП—2.а.6. Завантаження живильного середовища у колби. Рідке живильне середовище наливають у колби на 0,5 л з розрахунку 2/3 об'єму і останні скошують на похилій поверхні.

     ТП—2.а.7. Доведення рН. Як у ТП—2.2 розділу 4.1.1.5.

     ТП—2.а.8. Визначення вмісту амінного азоту, цукрози і фосфору. Як у ТП—З.а.6 розділу 4.1.1.5.

     ТП—2.а.9. Стерилізація середовища в колбах. Колби з середовищем стерилізують в автоклаві за температури 125°С протягом 1 години.

     ТП—2.а.10. Контроль середовища на стерильність. Як у ТП—1.9.

     ТП—2.а.П. Перенесення суспензії  в колби з середовищем. Перенесення суспензії здійснюють в мікробіологічному боксі стерильною піпеткою — по 2 мл суспензії наливають на скошений сус-ло-агар у півлітрові колби.

     ТП—2.а.12. Розподіл суспензії  по поверхні середовища. Рівномірного розподілу суспензії по поверхні середовища досягають похитуванням колби.

     ТП—2.а.13. Закривання скляних  місткостей паперовими ковпачками. Колби на 0,5 л закривають паперовими ковпачками, які закріплюють шпагатом або гумкою, і переносять у термостат.

     ТП—2.а.14. Культивування. Колби встановлюють в термостаті горизонтально і культивують протягом 25—35 діб за температури 26°С.

     ТП—2.а.15. Забезпечення додаткового  освітлення. Для стимулювання спороутворення (10—15-й день культивування) грибу необхідно додаткове освітлення, що забезпечують ввімкненням підсвічувача.

     ТП—2.а.16. Контроль маточної культури. Маточну культуру візуально перевіряють на чистоту, для цього відбирають 2—5% колб і визначають наявність чи відсутність колоній сторонніх мікроорганізмів на поверхні субстрату і корка.

     ТП—2.а.17. Зберігання маточної культури. Маточну культуру зберігають у холодильнику за температури 4—6°С протягом 2—3 місяців.

     ТП—2.а.18. Підготовка маточної культури до застосування. Безпосередньо перед використанням з маточної культури готують суспензію спор, для цього у пляшку в стерильній зоні полум'я спиртівки вливають 250—300 мл стерильної води, стерильним шпателем кілька разів проводять по поверхні середовища для відділення спор від субстрату і переносять їх у воду.

     ТП—2.6. Одержання маточної культури на рідкому  живильному середовищі.

     ТП—2.6.1. Підготовка колб. Колби місткістю 2 л ретельно миють, висушують, готують ватно-марлеву серветку, гумку для зав'язування; колбу переносять і вміщують в автоклав.

     ТП—2.6.2. Стерилізація. Як у ТП—2.а.2.

     ТП—2.6.3. Стерилізація води. Як у ТП—2.а.3.

     ТП — 2.6.4. Переливання води у колбу. Як у ТП—2.а.4.

     ТП—2.6.5. Приготування рідкого  живильного середовища для маточної культури. Середовище з пивного сусла готують, розбавляючи його питною водою з доведенням вмісту цукру до 8% та додаванням 2% агар-агару. Середовище з кукурудзяним екстрак-

     том містить такі компоненти:

     кукурудзяний  екстракт — 2%;

     крохмаль — 2%;

     цукроза — 2%

     NaNOОз - 0,3%;

     КH ₂Р0₄ - 0,1%;

     МgS0₄ - 0,05%;

     вода  питна — до 100%. Середовище з мелясою містить:

     кукурудзяний  екстракт — 1—2%;

     меляса — 10—15%;

     NаН ₂Р0 ₄ - 0,5%;

     (NН ₄) ₂Р0 ₄ - 0,25%;

     МgS0 ₄ - 0,1%;

     вода  питна — до 100%.

     ТП—2.6.6. Завантаження живильного середовища у колби. Простерилізовані колби на 1/2 або 2/3 заповнюють живильним середовищем, після чого закривають ватно-марлевими серветками та зав'язують шпагатом або гумками.

     ТП—2.6.7. Доведення рН. Розчинами їдкого натру або соляної кислоти з масовою часткою 10% доводять рН кукурудзяно-мелясового середовища до 6,0+0,1.

     ТП—2.6.8. Визначення вмісту амінного азоту, цукрози і  фосфору. Як у ТП-2.а.8.

     ТП —2.6.9. Стерилізація середовища в колбах. Як у ТП—2.а.9.

     ТП —2.6.10. Контроль середовища на стерильність. Як у ТП—1.9.

     ТП —2.6.11. Перенесення суспензії в колби з середовищем. Перенесення суспензії здійснюється в мікробіологічному боксі стерильною піпеткою — по 5 мл суспензії наливають в качалкові (2 л) колби з 150 мл рідкого живильного середовища кожна.

     ТП—2.а. 12. Закривання колб паперовими ковпачками. Як у ТП-2.а.13.

     ТП —2.6.13. Встановлення колб на качалку і встановлення параметрів культивування. Засіяні колби переносять у качалкове відділення і встановлюють на качалку типу КПМ-36/90. Температуру у відділенні встановлюють на рівні 26°С, частота обертання постійно працюючої качалки — 180 об./хв.

     ТП—2.6.14. Культивування в  колбах на качалці. Культивування ведуть протягом 5—7 діб до утворення сметаноподібної маси. Під час культивування стежать за додержанням режимів температури та частоти обертання качалки.

     ТП—2.6.15. Контроль маточної культури. Наприкінці культивування перевіряють чистоту маточної культури мікроскопіюван-ням мазків (збільшення 7 х 40).

     ТП—2.6.16. Зберігання маточної культури. Маточну культуру зберігають у холодильнику за температури 4—6°С протягом 10 днів.

     777—2.6.17. Підготовка маточної культури до застосування. Маточну культуру гриба використовують безпосередньо для інокуляції середовища за масового вирощування культури.

     Стадія  ТП—3. Масове культивування гриба.

     Масово  гриб культивують як на агаризованому, так і на рідкому живильному середовищі.

     ТП—З.а. Масове культивування  гриба на агаризованому  живильному середовищі.

     ТП—З.а1. Приготування живильного середовища. Ашерсонію можна вирощувати на зерні (кукурудза, ячмінь), шматочках буряків, картоплі, але найкращим живильним середовищем є неохмелене пивне сусло. Його розливають у скляний посуд і стерилізують в автоклаві за 0,05 МПа протягом 30 хв. Стерильне сусло можна зберігати в темному та прохолодному приміщенні до року. Перед приготуванням живильного середовища цукрометром визначають вміст цукру в суслі і розбавляють останнє питною водою до цукристості 8%, доводять рН до 6,0. В посуд з живильним середовищем додають 2% агар-агару і підігрівають при періодичному помішуванні до повного розплавлення агару.

     ТП—З.а.2. Стерилізація. Стерилізують колби на 0,5 л в автоклаві під тиском 0,18—0,2 МПа протягом 1 години. Після закінчення стерилізації і зниження тиску в автоклаві до атмосферного колби ставлять на охолодження при кімнатній температурі і переносять у відділення приготування живильного середовища.

     ТП—З.а.З. Завантаження живильного середовища у колби. У стерильні колби розливають тепле агаризоване живильне середовище — 100 мл у кожну.

     ТП—З.а.4. Закривання колб паперовими ковпачками. Як у ТП-2.а.13.

     ТП—З.а.5. Стерилізація. Колби з живильним середовищем стерилізують в автоклаві протягом 30 хв за тиску 0,05 МПа.

     ТП—З.а.6. Охолодження і  одержання косяків. Після стерилізації дверцята автоклава трохи прочиняють на 15—20 хв для підсихання корків. Потім колби переносять з автоклава, встановлюють на похилу поверхню в мікробіологічному боксі для застигання середовища за температури 24—26°С при постійному опроміненні їх бактерицидною лампою протягом 1 — 1,5 годин. У результаті одержують косяки максимального розміру, при цьому заливання корків не допускається.

     ТП—З.а. 7. Контроль на стерильність. Як у ТП—1.9.

     ТП—З.а.8. Засівання суспензією спор колб із середовищем. Для засівання кожної з колб беруть по 2 мл маточної суспензії, що містить близько 1 х 106 спор, стерильною моровською піпеткою з відпиляним носиком. Однієї маточної колби достатньо для інокуляції не більше ста 0,5 л колб із середовищем.

     ТП—З.а.9. Закривання колб паперовими ковпачками. Після засіву кожну колбу закривають ватним корком та паперовим ковпачком, закріплюючи його шпагатом або гумкою.

     ТП—З.а. 10. Розподіл суспензії  по поверхні середовища. Рівномірний  розподіл  інокуляту по  поверхні середовища досягається похитуванням колб.

     ТП—З.а.11. Розміщення засіяних колб. Засіяні колби розкладають у горизонтальному положенні (середовищем донизу) на стелажі у термостатованій кімнаті.

     ТП—З.а.12. Культивування. Культивують у термостатованій кімнаті за температури 24—28°С протягом 20—35 діб.

     ТП—З.а. 13. Забезпечення додаткового освітлення. Забезпечення додаткового освітлення необхідне для стимулювання спороутворення на 5—7-му добу культивації і досягається вмиканням підсвічувача.