Разработка технологии высокоэффективной реактивации шампанских сухих винных дрожжей

Сушка.

           Сушку дрожжей осуществляют с использованием сушилки в кипящем слое. При этом дрожжи прогреваются до температуры 32-34 градуса, а длительность сушки обычно составляет 30-50 минут.

Упаковка  готового продукта.

          Полученные дрожжи, упаковывают под вакуумом или в атмосфере СО₂ или N₂ , в воздухонепроницаемую упаковку, что и обеспечивает им сохранность в течение 12, а иногда и до 30 месяцев. Наиболее излюбленной упаковкой являются пакеты из фольги вместимостью в 500 грамм – именно в таком виде их удобнее всего использовать в производстве.

          В готовых препаратах производителями АСВД обычно контролируются следующие параметры: содержание сухих веществ, число клеток, число живых клеток, бродильная активность, газообразующую способность, наличие посторонней микрофлоры [37].

6. Научные основы рационального использования препаратов АСВД.

          Как уже отмечалось, современные методы культивирования и сушки дрожжей позволяют свести к минимуму вредное воздействие термического воздействия на их клетки, не допуская повреждений их генетического аппарата, т.е. сохраняя все свойства исходных культур. Тем не менее, целостность многих структур и макромолекул клеток дрожжей в той или иной степени все же нарушается. Особенно сильно от термостресса страдают клеточная стенка и мембранные структуры клеток, что вызывает нарушение их барьерных функций. Кроме того, в той или иной степени повреждаются белоксинтезирующая система (разрушение части рибосом и рРНК), а также митохондриальная система энергообеспечения (дыхательная цепь, фосфорилирование ит.д.). При попадании в жидкую среду части клеток оказывается не в состоянии восстановить полученные повреждения, и погибают. Таким образом, процент гибели клеток, зависит не только от степени повреждений во время сушки, но также и условий, в которые попадают уже высушенные клетки.

             В связи с этим, данные о событиях, происходящих в клетках сухих винных дрожжей во время восстановления их жизнеспособности и физиологических функций, а также об условиях, в максимальной степени благоприятствующих этим процессам, имеют огромное практическое значение.

1. Процессы восстановления физиологических функций клеток сухих дрожжей и жизнеспособности их популяции.

          Наиболее глубокие исследования в этом направлении были проведены специалистами Института Микробиологии АН Латвийской ССР под руководством М.Е.Бекера. Согласно их концепции, выход высушенных клеток из анабиоза происходит в три этапа:

• регидратация (увлажнение);
• реактивация (ликвидация повреждений клеточных структур);
• рост и размножение клеток.

Регидратация.

            Это чисто физический процесс, когда происходит насыщение клеток водой. Продолжительность его очень небольшая и составляет всего лишь несколько минут. В течение 1-2 минут вода проходит клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану, однако для заполнения пространства внутри клеток обычно требуется еще около 8-10 минут. Предполагается, что при этом часть обратимо поврежденных структур клеток приобретает нативный вид.

             Следует отметить, что скорость обводнения дрожжей во многом зависит от температуры окружающей среды.  Чем выше температура окружающей среды, тем быстрее набухают и приобретают свою первоначальную структуру структуры клетки, вследствие чего обеспечивается барьер, препятствующий выходу сухих веществ из клетки. Это очень важно, поскольку именно в период регидратации клетки сухих дрожжей, из-за повышенной проницаемости их мембран и клеточной стенки могут терять до 20% сухих веществ. В водную среду главным образом переходят свободные аминокислоты, другие азотистые вещества, жизненно важные витамины – никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин и незначительное количество биотина [15]. Происходят также потери минеральных веществ – калия, натрия, магния, микроэлементов [13]. Это приводит к тому, что клеточные структуры, повреждающиеся при высушивании, восстанавливают свою структуру при регидратации обычным способом очень медленно.

       Между тем, выход СВ из клеток можно регулировать с помощью температуры среды реактивации. Максимальный выход СВ наблюдается при помещении дрожжей в холодную воду, что вызывает так называемый холодовой шок. При этом дрожжи теряют 40% углеводов, 50-60% зольных элементов, 50% никотиновой кислоты. Считается, что причиной этого является то, что при низких температурах происходит кристаллизация мембранных липидов, и в мембранах возникают каналы. В связи с этим, оптимальной температурой считается 35-45 градусов.

            Предлагаются и другие способы регидратации. Так, например, хорошие результаты обеспечивает регидратация сухих клеток постепенно парами воды при скорости 0,01-0,1 мг воды на 1 мг СВ дрожжей в секунду. В этой связи значительный интерес представляют собой данные, полученные относительно недавно о том, что постепенное увлажнение клеток сухих дрожжей обеспечивает значительно большую их выживаемость, чем при быстром увлажнении [31].

Реактивация.

           Это процесс, связанный с ликвидацией повреждений и восстановлением функций органоидов клеток дрожжей, в результате чего они приобретают способность расти и размножаться. В ходе реактивации протекают следующие процессы:

• биосинтез новых макромолекул вместо поврежденных;
• компенсация функций поврежденных структур резервными механизмами;
• репарация поврежденных структур

       Интенсивность этих процессов определяет длительность лаг-фазы развития, в которую при  благоприятных условиях (наличие  ресурсов энергетического и конструктивного  обмена, оптимальных значениях температуры, рН и т.д.) вступают регидратированные клетки дрожжей.             

Известно, что неповрежденные структуры клеток после их увлажнения восстанавливают  свою функциональную активность очень  быстро. В то же время полное восстановление активности поврежденных клеточных  структур требует определенного времени – времени реактивации. Это и является основной причиной того, что если у исходных необезвоженных дрожжей длительность лаг-фазы составляет 1 час, то у сухих дрожжей лаг-фаза длится приблизительно 3 часа.

           Следует отметить, что в период реактивации в первую очередь восстанавливается вакуолярный аппарат клеток и митохондрии. Установлено также, что число митохондрий в обезвоженных дрожжах во время реактивации превышает их количество в интактных клеток, что свидетельствует об интенсификации процессов репарации, требующих повышенного количества энергии.

               К концу периода лаг-фазы практически полностью восстанавливается поверхность и форма ядра, нормализуется структура и проницаемость цитоплазматической мембраны. Наряду с репарацией клеточных структур в это время происходят и серьезные изменения в химическом составе дрожжей. Активизируется деятельность многих ферментных систем, что приводит к усилению синтеза нуклеиновых кислот, белков, полифосфатов и других макромолекул клетки, что обуславливает переход клеток дрожжей в фазу роста и размножения.

Рост  и размножение  клеток.

                Поскольку во время обезвоживания часть клеток погибает, то для восстановления численности клеток до первоначального уровня (до сушки) также требуется определенное время, которое получило название стадии восстановления численности клеток, которая, как принято считать, следует за стадией реактивации.

                Процессы реактивации и роста клеток протекаю одновременно. При этом восстановление численности клеток происходит за счет активации неповрежденных клеток, у которых процесс размножения начинается гораздо раньше, чем у поврежденных, которые в это время проходят стадию репарации повреждений. Общая же скорость нарастания биомассы сухих дрожжей гораздо ниже. Так, установлено, что сухие дрожжи почкуются гораздо медленнее и максимума почкования достигают только через 4,5 часа, в то время как прессованные – через 1,5 часа.

2. Методы реактивации сухих винных дрожжей.

             Необходимость в разработке специальных методов подготовки сухих винных дрожжей к процессу брожения обусловлена тем, что они характеризуются повышенной проницаемостью мембран. Это приводит, с одной стороны к очень высокой чувствительности сухих дрожжей к наличию в среде к различным ингибиторам, а с другой, обуславливает выход в среду различных компонентов их клеток – аминокислот, витаминов и минеральных веществ, что затрудняет нормальное протекание процессов репарации и восстановления их физиологической активности.

           Практика показывает, что простое внесение сухих винных дрожжей непосредственно в сусло или виноматериал, может приводить к гибели значительного количества клеток - до 30-40% и выше. Это происходит по разным причинам – при внесении сухих дрожжей в холодное сусло, что приводит к резкому торможению восстановления функциональной активности дрожжей; при наличии в сусле веществ в значительной степени ингибирующих дрожжевые клетки на этапе их регидратации (фунгициды, сернистый ангидрид, летучие кислоты).

               В связи с этим, общепризнанно, что этапы обводнения клеток дрожжей (регидратации) и восстановления функциональной активности всех их органелл и ферментных систем (реактивацию) следует проводить в оптимальных условиях, после чего их можно отправлять на брожение.             Тем не менее, следует отметить, что серьёзных исследований по оптимизации процессов регидратации и реактивации сухих винных дрожжей до последнего времени практически не проводилось. Об этом свидетельствует тот факт, что до сих пор нет окончательного мнения об оптимальных значениях таких важнейших параметров, как рН, температура и составе среды реактивации.

            Так, например, считается, что оптимальной температурой для реактивации АСВД является температура 35-40 °С, поскольку при этом наблюдается минимальный выход веществ клетки в среды. При этом учитываются данные более ранних исследований, в которых для сухих хлебопекарных дрожжей было показано, что при реактивации их в холодной воде клетки могут терять до 40% углеводов и 50% минеральных веществ, что резко их ослабляет, в то время как при реактивации при температуре 43°С потеря питательных веществ была в 2 - 4 раза меньше [25]. В тоже время известно немало работ, когда вполне нормальные результаты получались при использовании других температур – 16-20°С [7], а также 20-25°С [16].

            Достаточно спорным вопросом является состав среды реактивации. Еще в конце 70-х – начале 80-х годов прошлого столетия были проведены сравнительные исследования по использованию в качестве среды реактивации воды и виноградного сусла. При этом было установлено, что и вода, и виноградное сусло могут успешно применяться для восстановления активности дрожжей, причем различия между ними невелики [28,35]. В связи с этим, наиболее широко используемым в виноделии способом реактивации является разведение необходимого количества АСД в 10-кратном количестве воды или виноградного сусла, нагретых до температуры 35-40 °С. После выдержки в течение 20-30 минут (за этот период полностью проходит процесс регидратации, длящийся 5-10 минут, и восстанавливается первоначальный вид клеточных структур), полученную суспензию дрожжей переводят в приготовленное сусло или бродильную смесь [26,30].

             В последние годы интерес к процессам регидратации и реактивации сухих винных дрожжей значительно усилился, поскольку теперь четко стали понимать то, что правильное проведение этих процессов обеспечивает эффективность применения препаратов АСВД в целом [22, 24, 27]. В связи с этим в настоящее время все фирмы – производители АСВД прилагают к своим препаратам подробные схемы их подготовки к брожению.

3. Особенности подготовки шампанских АСД.

      Эта группа препаратов АСВД в настоящее  время нашла широкое применение на заводах, производящих игристые вина, в том числе и отечественных. Тем не менее, выяснилось, что нередко их использование приводит к удлинению процесса брожении, недобродам и ряду других проблем. Причиной этого являются достаточно тяжелые условия, принятые в шампанском производстве – довольно низкая температура брожения (12-15 градусов) и высокое содержание спирта в среде (до 10 % об.), а, с другой, высокая чувствительность сухих дрожжей к неблагоприятным условиям, обусловленная повышенной проницаемостью их мембран и клеточных стенок. Сочетание этих факторов и обуславливало то, что уже на первых этапах применения шампанских АСД наблюдалось их сильное ингибирование со всеми вытекающими последствиями. Поэтому, специалистами компаний, производящих препараты шампанских АСД, были разработаны достаточно процессы их подготовки, позволяющие адаптировать их к работе в условиях шампанского производства [8].

      Анализ  данных методов показал, что все  они предусматривают регидратацию дрожжей, которая представляет собой  замачивание дрожжей в 10-кратном  объеме теплой воды в течение 30-40 минут, и адаптацию их к спирту, заключающуюся в выдержке дрожжей в смеси виноматериала и ликера в течение 12-24 часов. В последующем, некоторые фирмы рекомендуют проводить дополнительное культивирование полученной суспензии дрожжей еще в течение 1-2 суток, другие – допускают использование полученной суспензии непосредственно для проведения вторичного брожения.