Необов’язкові компоненти структури бактеріальної клітини: спори, капсули, включення. Методи фарбування для їх виявлення

МІНІСТЕРСТВО  ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ  МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. Богомольця

КАФЕДРА МІКРОБІОЛОГІЇ, ВІРУСОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ 

(Завідувач  кафедрою академік НАН України,  д.м.н.,

професор  В.П. Широбоков) 
 
 
 
 
 
 

КОНТРОЛЬНА  РОБОТА №1

Студентки 2 А групи 2 курсу

Фармацевтичного факультету

заочної форми 5,5 років навчання

Мхако Полінарья  Мпапалікаєвна

номер залікової  книжки

102123 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Київ, 2012 рік 

    Зміст роботи 

1.3. Необов’язкові  компоненти структури бактеріальної  клітини: спори, капсули, включення. Методи фарбування для їх виявлення.

2.3. Особливості  хімічного складу бактерій порівняно  з еукаріотичними клітинами.

3.3. Хімічний  склад вірусів. Особливості та  функції вірусних нуклеїнових  кислот, білків, ліпідів, вуглеводів. Ферменти вірусів.

4.3. Хімічний (газовий  та розчинами), фільтруванням і  радіаційний методи стерилізації.

5.3. Позахромосомні  фактори спадковості бактерій: плазміди  та мігруючі генетичні елементи.

6.3. Антагонізм  мікробів, біологічна роль. Механізми.

7.3. Мікрофлора  природних вод. Фактори самоочищення водоймищ. Використання води в фармацевтичній промисловості.

8.3.Патогенність. Вірулентність. Одиниці виміру  вірулентності. 

9.3. Коопераці  Т-, В- лімфоцитів та макрофагів  у процесі імунної відповіді.  Біосинтез антитіл. Динаміка утворення антитіл. Імунологічна пам’ять.

10.3. Анатоксини. Характеристика. Одержання. Визначення  сили анатоксинів. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1.3. Необов’язкові  компоненти структури бактеріальної  клітини: спори, капсули, включення.  Методи фарбування для їх виявлення.

    Бактерії  – прокаріоти, тому їх структура  відрізняється від структури  клітин рослин і тварин (евкаріотів). Бактерії не мають ядерної оболонки, мітохондрій та апарату Гольджі. Вони мають клітинну стінку, яка  є лише в прокаріотів.

Деякі бактерії утворюють спори, містять включення та плазміди.

Поверхневі структури. До них відносять капсулу, джгутики, мікровійки. Наявність або відсутність  їх є постійною ознакою для  даного виду. Це враховують під час  ідентифікації мікроорганізмів.

Капсула. Розрізняють мікро- та макрокапсулу, або слизовий шар.

    Мікрокапсулу  виявляють за допомогою Електронної  мікроскопії. Вона представлена мукополісахаридними  фібрилами. Роль її остаточно не з'ясовано.

    Макрокапсула  – це стовщений слизовий шар, його мають не всі мікроорганізми. Оскільки капсула має гелеподібну консистенцію, вона не затримує барвників, тому при забарвленні за Буррі – Гінсом забарвлюється фон препарату та клітина, а сама капсула лишається безбарвною. У деяких мікроорганізмів (збудників пневмонії, сибірки та ін.) капсули утворюються в організмі людини або тварини, а в деяких – як у макроорганізмі, так і на штучних живильних середовищах (S. aureus, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis та ін.). У патогенних мікроорганізмів капсула може оточувати одну (збудник чуми – Y. pestis) чи дві клітини (збудник пневмонії – S. pneumoniae), навіть цілий ланцюжок клітин (збудник сибірки). Капсула захищає клітину від бактеріофагів, фагоцитів та антитіл. Тому вона є фактором патогенності (пневмококи, що втрачають капсулу, стають непатогенними). ,

    Вона  обумовлює антигенні властивості  мікроорганізмів (К-антиген – капсульний антиген).

    Слизовий  шар. Бактерії часто виділяють велику кількість слизу, котрий утворює  навколо них пухкий шар.

    Джгутики  мають не всі мікроорганізми. За кількістю та розміщенням джгутиків мікроорганізми поділяють на такі групи (мал. 4):

    монотрихи – один джгутик розміщується на полюсі клітини (холерний вібріон);

    лофотрихи – пучок джгутиків розміщується на одному кінці (синьогнійна паличка);

    амфітрихи – пучок джгутиків розміщується на обох кінцях (спірили);

    перитрихи – джгутики розміщуються на всій поверхні клітини (сальмонели, ешерихії та ін.).

    Такий поділ мікроорганізмів є досить умовним. Дані електронної мікроскопії  свідчать про те, що монотрихи мають кілька джгутиків, а амфітрихи – ,це дві клітини монотрихів, що не повністю поділилися.

    За  допомогою джгутиків мікроорганізми рухаються. Для виявлення їх рухливості використовують такі методи:

    1) мікроскопічний – фазово-контрастна  або звичайна світлова мікроскопія "роздавленої" або "висячої" краплі;

    2) бактеріологічний – посів штриком  у стовпчик напівщі-льного агару:  рухливі бактерії ростуть дифузно,  а нерухливі – тільки там,  де зроблено посів.

    Мікровійки. Окрім джгутиків, поверхню бактерій вкривають мікровійки. Розрізняють 2 типи мікровійок: 1) фімбрії, або війки; 2) кон'югативні, або донорські (F-пілі).

    Фімбрії–  це короткі тонкі волоски, їх може бути від 10 до кількох тисяч. Вони є  фактором патогенності. За допомогою  фімбрій бактерії прикріпляються до чутливих клітин (адгезія), де потім розмножуються (колонізація).

    F-пілі  – довгі тонкі ниткоподібні  структури. Бактерія може мати 1–2 такі структури. Вони є  апаратом кон'югації у бактерій, які є носіями плазмід. F-пілі  забезпечують контакт між клітиною-донором і клітиною-реципієнтом, а також передачу спадкової інформації, що є в плазмідах.

    Клітинна  оболонка складається з клітинної  стінки і цитоплазматичної мембрани.

    Клітинна  стінка. Забарвлення залежить від  будови клітинної стінки, яка складається  з двох шарів: внутрішнього (ригідного) та поверхневого (пластичного). У грампозитивних мікроорганізмів більш виражений ригідний шар, утворений пептидогліканом (до 90 %), який містить тейхоєві кислоти. Пластичний шар майже не виражений. Крістіан Грам запропонував метод забарвлення мікроорганізмів генціановим фіолетовим і розчином Люголя, мікроорганізми при цьому забарвлюються у фіолетовий колір. Після обробки спиртом і промивання водою одні з них втрачали попереднє забарвлення і забарвлювалися фуксином Пфейффера в червоний колір, їх назвали грамнегативними. Мікроорганізми, які не втрачали фіолетового забарвлення, назвали грампозитивними.

    У грамнегативних мікроорганізмів виражені пластичний і ригідний шари. Пластичний шар складається з ліпополісаха-риду (ЛПС) і поверхневої мембрани (вони мозаїчно переплітаються), а також ліпопротеїдів. ЛПС запускає синтез близько

    20 сполук, що виявляють хвороботворну  дію на макроорганізм. 

    Патогенних  мікроорганізмів більше серед грамнегативних.

    Поверхнева  мембрана містить білки, які є рецепторами для фагів і коліцинів. Ці білки зумовлюють адгезію мікробів (здатність прикріплюватися до клітини макроорганізму).

    В експерименті (in vitro) можна зруйнувати клітинну стінку. Лізоцим руйнує лише пептидоглікан клітинної стінки грамнегативних мікроорганізмів, а поверхнева мембрана (або її частина) залишається неушкодженою. Бактерії, у яких частково зруйнована клітинна стінка, називають сферопластами. Після обробки грампозитивних бактерій ферментами, які руйнують пептидоглікан, утворюються протопласті – структури, у яких повністю зруйнована клітинна стінка.

    Роль  клітинної стінки:

    1) бере участь у рості та поділі  клітини;

    2) захищає від дії факторів зовнішнього  середовища та макрофагів (знижує  фагоцитарну активність макрофагів, гальмує їх міграцію);

    3) є фактором патогенності;

    4) визначає антигенну структуру  мікроорганізмів (О-антиген). 

    Спора – стійка форма бактерій . Зустрічається  переважно в паличкоподібних  мікроорганізмів, дуже рідко – у  коків і звивистих бактерій. Утворюються  спори протягом 18 – 20 год. Вони проростають протягом 4 – 5 год. Ніколи не утворюються в тканинах людей і тварин. Вони являють собою ущільнену ділянку цитоплазми з нуклеоїдом, укриту щільною багатошаровою оболонкою, яка містить ліпіди, велику кількість кальцію, мінімальну кількість води (близько 40 %) та інші сполуки, яких немає у вегетативних клітинах (наприклад, дипіколінову кислоту, завдяки якій спори є термостійкими).

    Спори стійкі до високих температур (спори  збудників ботулізму витримують кип'ятіння протягом 1–6 год), висушування, зміни рН. На них не діють дезінфекційні розчини. Спори можуть упродовж десятків років зберігатися в несприятливих умовах зовнішнього середовища. Це слід ураховувати при виборі методів знезаражування. Матеріал, що містить спори, знезаражують в автоклаві за температури 132 °С або в сухо-жаровій шафі за температури 150– 170 °С.

    Для початкової ідентифікації бактерій все, що широко використовується —  фарбування за Грамом, яке одразу поділяє  бактерії на дві великі групи та відрізняє їх від еукаріотів. Деякі організми краще всього ідентифікуються за допомогою інших методів фарбування, наприклад, кислотостійкі бактерії (Mycobacteria, Nocardia) краще всього ідентифікуються за допомогою фарбування за Зіль-Нельсеном або подібних методик. Інші організми може бути потрібно ідентифікувати за допомогою вирощування їх у спеціальному середовищі, або іншими, наприклад, серологічними методами.

    Методи  культур дозволяють зростання тільки певного виду або групи бактерій, обмежуючи ріст інших бактерій в  зразку. Часто ці методи розроблюються для специфічних зразків, наприклад, зразок слини розглядатиметься для ідентифікації організмів, які викликають пневмонію, а зразок калу розглядатиметься для ідентифікації організмів, які викликають пронос, запобігаючи зростанню нехвороботворних бактерій. Зразки, що зазвичай стерильні, наприклад, кров, сеча або спинна рідина, культивуються за умов, створених, щоб виростити всі можливі організми. Як тільки хвороботворний організм буде ізольований, він може бути охарактеризований фарбуванням, за своєю морфологію та метаболізмом (наприклад, аероб або анаероб) та гемолітичними властивостями. Як з класифікацією бактерій, для ототожнення бактерій все більше використовуються молекулярні методи. Діагностика за допомогою таких, заснованих на ДНК, методів, наприклад, полімеразної ланцюгової реакції, набуваює популярності завдяки її специфічності і швидкості, порівняно із методами, заснованими на культурі. 

2.3. Особливості  хімічного складу бактерій порівняно  з еукаріотичними клітинами.

    Клітина - універсальна одиниця живої матерії. За хімічним складом істотних відмінностей прокаріотичних та еукаріотичних клітин немає.  
Хімічні елементи, що входять до складу живої матерії, можна розділити на три основні групи.  
1. Біогенні хімічні елементи (С, О, N, H). На їх частку припадає 95% сухого залишку, в т.ч. 50% - C, 20% - O, 15% - N, 10% - H).  
2. Макроелементи - P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. На них припадає близько 5%.  
3. Мікроелементи-Fe, Cu, I, Co, Mo та ін На них припадають частки відсотка, однак вони мають важливе значення в обмінних процесах.  
Хімічні елементи входять до складу різних речовин - води, білків, ліпідів, нейтральних жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Синтез сполук контролюється генами. Багато речовин бактеріальна клітина може отримувати ззовні - з навколишнього середовища або організму господаря.  
Вода становить від 70 до 90% біомаси. Вміст води більше у капсульних бактерій, найменше - в суперечках.  
Білки зустрічаються у всіх структурних елементах клітини. Білки можуть бути більш прості (протеїни) складні (протеїди), в чистому вигляді або у комплексі з ліпідами, цукрами. Виділяють структурні (структуроутворюючі) і функціональні (регуляторні) білки, до останніх відносяться ферменти.  
До складу білків входять як звичайні для еукаріотів амінокислоти, так і оригінальні - діамінопімеліновая, D-аланін, D-глютанін, що входять до складу пептидогліканів та капсул деяких бактерій. Тільки у спорах знаходиться діпіколіновая кислота, з якою пов'язана висока резистентність суперечка. Джгутики побудовані з білка флагелліна, володіє скоротливою здатністю і вираженими антигенними властивостями. Пили (ворсинки) містять особливий білок - пилина.  
Пептидний природи мають капсули представників роду Bacillus, збудника чуми, поверхневі антигени ряду бактерій, у тому числі стафілококів і стрептококів. Білок А - специфічний білок S.aureus - фактор, обусловлавлівающій ряд властивостей цього збудника. Білок М - специфічний білок гемолітичних стрептококів серогрупи А, дозволяє диференціювати серовар (близько 100), що має епідеміологічне значення.  
Ряд білків містить зовнішня мембрана грамнегативних бактерій, з яких 3 - 4 мажорних (основних) і більше 10 - другорядних, що виконують різні функції. Серед мажорних білків - поріни, що утворюють дифузні пори, через які в клітку можуть проникати дрібні гідрофільні молекули.  
Білки входять до складу пептидоглікану-біополімеру, що становить основу бактеріальної клітинної стінки. Він складається з остову (чергуються молекули двох аміноцукрів) і двох наборів пептидних ланцюжків - бокових і поперечних. Наявність двох типів зв'язків-глікозидних (між аміноцукрів) та пептидних, які з'єднують субодиниці пептидогліканів, надають цьому гетерополімеру структуру молекулярної мережі. Пептидоглікану-найбільш стійке з'єднання, яке утворює ригідну мішкоподібну макромолекулу, визначальну постійну форму бактерій і ряд їх властивостей.  
1. Пептидогликан містить родо-і видоспецифічні антигенні детермінанти.  
2. Він запускає класичний і альтернативний шляхи активації системи комплементу.  
3. Пептидогликан гальмує фагоцитарну активність і міграцію макрофагів.  
4. Він здатний ініціювати розвиток гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ).  
5. Пептидогликан має протипухлинну дію.  
6. Він має пірогенну дію, тобто викликає лихоманку.  
З сполук білків з небілковими компонентами найбільше значення мають ліпопротеїди, глікопротеїди і нуклеопротеїни.  
Дивовижне таїнство життя - синтез білка здійснюється в рибосомах. Існує два основних типи рибосом - 70S (S-константа седиментації, одиниця Сведберга) і 80S. Рибосоми першого типу зустрічаються лише у прокаріотів. Антибіотики не діють на синтез білка в рибосомах типу 80S, поширених у еукаріотів.  
Ліпіди (головним чином форфоліпіди) містяться в цитоплазматичній мембрані (ліпідний бішар), в також в зовнішній мембрані грамнегативних бактерій. Є мікроорганізми, які містять велику кількість ліпідів (до 40% сухого залишку) - мікобактерії. До складу ліпідів входять різні жирні кислоти, вельми специфічні для різних груп мікроорганізмів. Їх визначення має в ряді випадків діагностичне значення, наприклад у анаеробів, мікобактерій.  
У мікобактерій туберкульозу в складі ліпідів є ряд кислотостійких жирних кислот - фтіоновая, міколовая та ін Високий вміст ліпідів та їх склад визначають багато властивостей мікобактерій туберкульозу:  
-Стійкість до кислот, лугів і спиртів;  
-Важка окрашиваемость барвниками (використовують спеціальні методи забарвлення, частіше-за Цілем-Нільсену);  
-Стійкість збудника до сонячної радіації та дезосредствам;  
- Патогенність.  
Тейхоєвих кислоти зустрічаються в клітинних стінках грампозитивних бактерій. Представляють собою водорозчинні лінійні полімери, що містять залишки гліцерину або рібола, пов'язані фосфодіефірних зв'язків. З тейхоєвих кислотами пов'язані головні поверхневі антигени ряду грампозитивних бактерій.  
Вуглеводи зустрічаються частіше у вигляді полісахаридів, ктором можуть бути екзо-і ендоклеточнимі. Серед екзоклеточних полісахаридів виділяють каркасні (входять до складу капсул) та істинно Екзополісахариди (виходять у зовнішнє середовище). Серед бактеріальних полісахаридів багато хто знаходить медичне застосування. Декстран - полісахариди з великою молекулярною масою, з вигляду нагадують слиз. 6% розчин-кровозамінник поліглюкін. Декстранових гель сефадекса використовується в колонкової хроматографії як молекулярне сито. Ендоклеточние полісахариди - запасні поживні речовини клітини (крохмаль, глікоген та ін.)  
Ліпополісахариди (ЛПС) - один з основних компонентів клітинної стінки грамнегативних бактерій, це з'єднання ліпіду з полисахаридом. ЛПС складається з комплексу: 1.Ліпід А.  
2. Однакове для всіх грамнегативних бактерій полисахаридной ядро.  
3. Термінальна сахароїдними ланцюжок (О - специфічна бічний ланцюг).  
Синоніми ЛПС - ендотоксин, О - антиген.  
ЛПС виконує дві основні функції - визначає антигенну специфічність і є одним з основних факторів патогенності. Це - ендотоксин, токсичні властивості якого проявляються переважно при руйнуванні бактеріальних клітин. Його токсичність визначається ліпідом А. ЛПС запускає синтез більше 20 біологічно активних речовин, що визначають патогенез ендотоксикозу, володіє пірогенним дією.  
Нуклеїнові кислоти - ДНК і РНК. РНК (РНК) знаходяться головним чином у рибосомах (р-РНК-80 - 85%), т (транспортні) - РНК-10%, м (матричні) - РНК-1 - 2%, головним чином у одноланцюжковою формі. ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) може перебувати в ядерному апараті (хромосомна ДНК) або в цитоплазмі у спеціалізованих утвореннях - плазмідах - плазмідна (позахромосомних) ДНК. Мікроорганізми відрізняються за структурою нуклеїнових кислот, змісту азотистих основ. Генетичний код складається всього з чотирьох літер (підстав) - А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин). Найбільш часто для характеристики мікроорганізмів використовують як таксономічний ознака процентне співвідношення Г / Ц, яке суттєво відрізняється у різних груп мікроорганізмів.  
Мікроорганізми синтезують різні ферменти - специфічні білкові каталізатори. У бактерій виявлено ферменти 6 основних класів.  
1. Оксидоредуктази - каталізують окисно-відновні реакції.  
2. Трансферази - здійснюють реакції перенесення груп атомів.  
3. Гідролази - осущесвляют гидролитическое розщеплення різних сполук.  
4. Ліази - каталізують реакції відщеплення від субстрату хімічної групи негідролітіческім шляхом з утворенням подвійного зв'язку або приєднання хімічної групи до подвійних зв'язків.  
5. Лігази або синтетази - забезпечують з'єднання двох молекул, поєднане з розщепленням пірофосфатная зв'язку в молекулі АТФ або аналогічного трифосфату.  
6. Ізомерази - визначають просторове розташування груп елементів.  
Відповідно до механізмами генетичного контролю у бактерій виділяють три групи ферментів:  
- Конститутивний, синтез яких відбувається постійно;  
- Індуцибельних, синтез яких індукується наявністю субстрату;  
- Репрессібельние, синтез яких пригнічується надлишком продукту реакції.  
Ферменти бактерій ділять на екзо-і ендоферменти. Екзоферментів виділяються в зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук. Здатність до утворення екзоферментів багато в чому визначає інвазивність бактерій-здатність проникати через слизові, сполучнотканинні та інші тканинні бар'єри.  
Приклади: гіалуронідаза розщеплює гіалуронову кислоту, що входить до складу міжклітинної речовини, що підвищує проникність тканин (клостридії, стрептококи, стафілококи та багато інших мікроорганізми); нейрамінідаза полегшує подолання шару слизу, проникнення всередину клітин і поширення в міжклітинному просторі (холерний вібріон, дифтерійна паличка, вірус грипу та багато інших). До цієї ж групи належать ензими, розкладають антибіотики.  
У бактеріології для диференціації мікроорганізмів за біохімічними властивостями основне значення часто мають кінцеві продукти і результати дії ферментів. Відповідно до цього існує мікробіологічна (робоча) класифікація ферментів.  
1.Сахаролітіческіе.  
2.Протеолітіческіе.  
3.Аутолітіческіе.  
4.Окіслітельно - відновні.  
5.Ферменти патогенності (вірулентності).  
Ферментний склад клітини визначається геномом і є досить постійною ознакою. Знання біохімічних властивостей мікроорганізмів дозволяє ідентифікувати їх по набору ферментів. Основні продукти ферментирование вуглеводів і білків-кислота, газ, індол, сірководень, хоча реальний спектр для різних мікроорганізмів набагато більш великий.  
Основні ферменти вірулентності - гіалуронідаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейрамінідаза, ДНК-аза. Визначення ферментів патогенності має значення при ідентифікації ряду мікроорганізмів і виявлення їх ролі в патології.  
Ряд ферментів мікроорганізмів широко використовується в медицині і біології для отримання різних речовин (аутолітичних, протеолітичні), в генній інженерії (рестриктаз, лігази).