, где

     IU – активность фермента в международных единицах;

     РВ₁ и РВ₀ – редуцирующие вещества после и до ферментолиза, соответственно;

     D – разбавление фермента перед внесением в реакционную смесь;

     Н – дозировка препарата, мл;

     20 – время ферментолиза, мин.

     Специфическую активность рассчитывали как отношение  ксиланазной активности к общему количеству биомассы.

     Среднюю удельную скорость накопления ферментов (e,час^-1) по аналогии с удельной скоростью роста определяли по формуле:

      

, где

     А₀ – величина активности ферментов в начале отрезка времени;

     А₁ – в конце отрезка времени.

     Общую активность фермента рассчитывали по формуле:

      

, где

     IU_общ – общая активность;

     V – обьем раствора.

     2.5 Анализ редуцирующих сахаров

     Анализ  проводили следующим образом: к 120 мкл исследуемой пробы добавляли 1200 мкл дистиллированной воды и 600 мкл DNSA. Ставили пробы на 10минут в водяную баню при 100°С, затем на 5 мин. В ледяную баню. После этого добавляли во все пробы по 6 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при 540 нм (Shimadzu UV-1800, Япония). В качестве контроля использовали дистиллированную воду вместо пробы.

     2.6 Определение pH оптимума ферментов

     Были  проведены исследования влияния  рН среды на активность препаратов, полученных при глубинном культивировании T. citrinoviride на послеспиртовой барде.

     Исследования  проведены согласно методике (Christakopoulos P., 1996), предполагающей применение разных буферных растворов со значениями рН – 4, 5, 6, 7, 8, 9.

     2.7 Статистическая обработка данных

     Для статистической обработки данных использовали программу Excel. Для сравнения применяли интервальные оценки. Уровень значимости р < 0,05. Данные на рисунках представлены как среднее ± стандартное отклонение [Акберова, 2004].

     3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

     В настоящее время для обеспечения  успешного культивирования и  снабжения микромицета Trichoderma основными питательными компонентами используется сложная технология приготовления культуральной среды, которая описывается в следующей схеме:

     Из  схемы видно, что это длительный и дорогой процесс, он предполагает наличие 9 стадий. Основным компонентом  этой среды является экстракт ржи. Максимальная активность, полученная на этой среде при культивировании T. asperellum была 8.5 IU/ml на 4 сутки культивирования [Скворцов 2004].

     Между тем, существует крупнотоннажный отход спиртового производства – послеспиртовая барда, которая содержит основные источники С и N, необходимые при культивировании грибов рода Trichoderma. Послеспиртовая барда состоит из суспензии, содержащей взвешенные нерастворимые частицы, которые могут быть осаждены центрифугированием, и растворённых в жидкой фазе компонентов. В данной работе мы провели культивирование продуцентов гидролитических ферментов на осаждённой центрифугированием барде.

     3.1 Анализ активности ксиланаз при культивировании микромицетов рода Trichoderma на послеспиртовой барде

     Природные популяции грибов представляют собой  мозаику клонов, одним из изолирующих  механизмов которых являются различные культурально-морфологические типы колоний, реакции вегетативной совместимости и гетерокариоз [Алимова, 2007].

      В работе была использована гетерогенная популяция Trichoderma citrinoviride, состоящая из материнского штамма T. citrinoviride 207 и 2-х его клонов T. citrinoviride 207(1), 207(2), выделенная из погребенных почв в районе расположения археологических памятников (рисунок 1). 

     Рисунок 1. Расщепление штамма T. citrinoviride 207 на клоны и отделение их от родительского изолята на основании вегетативной совместимости. 

     Штаммом с высокой ферментативной активностью  оказался клон T. citrinoviride 207(1). Так, максимальная ксиланазная активность наблюдалась у штамма на 5 сутки роста и составляла 59.4 IU/ml (рисунок 2). Максимальная удельная ксиланазная активность T. spp. 207(1) наблюдалась на 4 сутки культивирования – 20.2 IU/g (рисунок 3).

     

     Рисунок 2. Ксиланазная активность культуральной среды штаммов T. citrinoviride на осаждённой послеспиртовой барде в течение 7 суток роста.

     

     Pисунок 3 –Удельная ксиланазная активность культуральной среды штаммов T. citrinoviride на осаждённой послеспиртовой барде в течение 7 суток роста. 

     Изолятом  с низкой ферментативной активностью  оказался материнский штамм T. citrinoviride 207. Максимальная ксиланазная активность составляла 10.3 IU/ml (рисунок 2) на 5 сутки роста. Максимальная удельная ксиланазная активность T. spp. 207 наблюдалась на 4 сутки культивирования и составляла 3.0 IU/g (рисунок 3).

     3.2 Анализ редуцирующих сахаров

     Нами  было проведено исследование изменения концентрации редуцирующих сахаров в культуральной жидкости в процессе ферментации продуцентов (рисунок 4).

     

     Рисунок 4. Динамика изменения концентрации редуцирующих сахаров в культуральной среде штаммов T. citrinoviride в течение 7 суток роста. 

     Наблюдалось снижение содержания редуцирующих сахаров на протяжении всего процесса культивирования штаммов. В начале роста концентрация сахаров в среде составляла 6.9 г/л, 7.5 г/л, 6.3 г/л у штаммов T. spp. 207, 207(1), 207(1) соответственно. К концу процесса у изолята T. spp. 207 концентрация сахаров составляла 0.9 г/л, у T. spp. 207(1), 207(2) – 0.8 г/л (рисунок 4).

     Основная  часть снижения происходила за первые 4 дня, что говорит об активном потреблении редуцирующих сахаров в первые дни культивирования продуцентов.

     Как показывают полученные результаты, выход  синтеза фермента на стационарную фазу начинается в момент прекращения  потребления редуцирующих сахаров  из среды культивирования. Хотя в  среде и остаются редуцирующие сахара, которые не могут быть гидролизованы ферментным комплексом Trichoderma. К концу культивирования продуцента среда обедняется доступными источниками углеводов, а концентрация клеток в среде является высокой. Вследствие дефицита углеводов клетка испытывает дефицит энергии, в результате чего в ней повышается содержание цАМФ, которое является сигнальным веществом дефицита энергии. При высоком уровне цАМФ снимается репрессия генов, кодирующих гидролитические ферменты. Для начала экспрессии гена необходим индуктор, которого к концу культивирования нет. В связи с этим мы сделали предположение, что именно дефицит редуцирующих сахаров является причиной прекращения синтеза экзоферментов и переход продуцента в стационарную фазу.

     3.3 Влияние pH на активность ксиланаз

     При применении ферментов в составе кормов для сельскохозяйственных животных одной из их важнейших характеристик является зависимость проявления активности от рН среды.

     Нами  проведены исследования влияния  рН на активность полученных ферментных препаратов Trichoderma. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 5.

     Ксиланазная активность исследованных нами изолятов Trichoderma имеет оптимум рН в районе 5.0 – 6.0, резко снижается при приближении к рН 4 и еще более снижается при сдвиге рН в щелочном направлении. 

     

     Рисунок 5 – Зависимость активности ксиланаз грибов Trichoderma от рН.

     ВЫВОДЫ

 
     

1. Определена  максимальная ксиланазная активность у штаммов T. citrinoviride 207, 207(1), 207(2), составляющая 10.3 IU/ml, 59.4 IU/ml, 27.2.IU/ml соответственно. Максимальная удельная ксиланазная активность составляла 2.9 IU/g у штамма T. citrinoviride 207, 20.2 IU/g у T. citrinoviride 207(1), 9.0 IU/g у штамма T. citrinoviride 207(2).
2. Дефицит редуцирующих сахаров является причиной прекращения синтеза экзоферментов и перехода продуцента в стационарную фазу.
3. Ксиланазная активность изолятов Trichoderma имеет оптимум рН в районе 5.0 – 6.0, резко снижается при приближении к рН 4 и еще более снижается при сдвиге рН в щелочном направлении.

     СПИСОК  ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

 
     

1. Алимова, Ф. К. Биотехнология. Промышленное применение грибов рода Trichoderma [Текст] / Ф. К. Алимова, Д. И. Тазетдинова, Р. И. Тухбатова. – Казань, 2007. – 229 с. – ББК 30.16.
2. Акберова, Н. И. Описательная статистика. Интервальные оценки: Учебно-методическое руководство и сборник задач к практическим занятиям по курсу «Математические методы в биохимии» [Текст] / Н. И. Акберова. – Казань: Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина. − 2004. – 40с.
3. Крапивина, И. Г. Trichoderma viride [Текст] / И. Г. Крапивина, Т. П. Сизова, Л. А. Полякова // Микология и фитопатология.- 1975.- Т.9.- вып.2.- С.143-145.
4. Кучмина, Е. Ю. Влияние Trichoderma harzianum на токсические и мутагенные свойства почвы [Текст] / Е. Ю. Кучмина, Ф. К. Алимова, КС. Н. Киямова, О. Б. Иванченко // Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках: материалы всероссийской конференции, Санкт–Петербург. – 2001 – C. 30-31.
5. Марков, А. В. Свойства гемицеллюлаз ферментного комплекса Trichoderma longibrachiatum [Текст] / А. В. Марков, А. В. Гусаков, Е. И. Дзедзюля, Б. Б. Устинов, А. А. Антонов, О. Н. Окунев, А. О. Беккаревич, А. П. Синицин // Прикладная биохимия и микробиология.- 2006.- Т.42.- №6.- С.654-664.
6. Маркович, Н. А. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней (обзор) [Текст] / Н. А. Маркович, Г. Л. Кононова // Прикладная биохимия и микробиология.- 2003.- Т.39.- №4.- С.389-400.
7. Ненайденко, Г.Н.  Послеспиртовая барда в качестве органического удобрения [Текст] / Г.Н. Ненайденко, О.С.Журба, В.Д. Шереверов // Ликёроводочное производство и виноделие. – 2008.
8. Околелова, Т. М. Корма и ферменты [Текст] / Т.М. Околелова, А.В. Кулаков, С.А. Молоскин., Д.М. Грачев // Сергиев Посад: ВНИТИП. – 2001. – С.9-45.
9. Семёнова, М. В. Выделение и свойства внеклеточных β-ксилозидаз из грибов Aspergillus japonicus и Trichoderma reesei [Текст] /M. В. Семёнова // Биохимия. – 2009.- Том 74.- С. 1230-1237.
10. Серебряный, В. А. Ксиланаза Penicillium canescens: выделение гена, изучение его регуляции создание штамма – продуцента: автореф. дис. … канд. биол. наук / В.А. Серебряный ; Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов. –Москва, 2009. – 26 с.
11. Скворцов, Е. В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma [Текст] / Е. В. Скворцов, Ф.К. Алимова, Д. М. Абузярова // Вестник Казанского технологического университета.– 2005.– №1.– С.251-255.
12. Шариков, А. М. Гриб Trichoderma: антибиотическая активность метаболитов [Текст] / А. М. Шариков, И. А. Новицкий, В. Т. Манчук // Якутский Медицинский Журнал – 2011 - №1 – С.100-101.
13. Шульга, Т. Н. Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei: автореф. дис. … канд. хим. наук / Т. Н. Шульга; Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова. – Москва, 2008. – 23 с.
14. Cabrera, F. H. A. Identification and phytotoxical properties of fungi genus Trichoderma from ancient lands [Text] / Cabrera, F. H. A. Mukhametshina, R. T. Rafailova, E. A. Shishkin, A. B. Tukhbatova, R. I Tazetdinova, D. Yu. Alimova, F. K. // BioSciense Blog – Научный Биологический блог. – 2010.
15. Campbell, G. L. Enzyme application for monogastric feeds: a review [Text] / G. L. Campbell, M. R. Bedford M.R. // Canadian Journal of Animal Science. - 1992. - V.72. - P. 449-466.
16. Colina, A. Xylanase production by Trichoderma reesei Rut C-30 on rice straw [Text] / A. Colina, B. Sulbarán-De-Ferrer, C. Aiello, A. Ferrer // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2003. – V.108. – Issue 1–3. – P. 715-724.
17. de Vries, R. P. The Aspergillus niger faeB gene encodes a second feruloyl esterase involved in pectin and xylan degradation and is specifically induced in the presence of aromatic compounds [Text] / R.P. de Vries // Biochem. J. – 2002. – P.377–386.
18. IUPAC. Measurment of cellulase activities. 1987. P 257- 268.
19. König, J. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity [Text] / J. König, R.Grasser, H. Pikor, K. Vogel // Anal Bioanal Chem. – 2002. – V.37. – P. 80-87.
20. Lopez, G. Xylanase II from Trichoderma ressei QM 9414: comformational and catalytic stability to Chaotropes, Trifluoroethanol, and pH changes [Text] / G. Lopez, A. Bañares-Hidalgo , P. Estrada // J Ind Microbiol Biotechnol. – 2011 – 38 (1) – P. 113-25.
21. Lu, W. Influence of water activity and temperature on xylanase biosynthesis in pilot-scale solid-state fermentation by Aspergillus sulphureus [Text] / W. Lu, D. Li, Y.Wu // Enzyme and Microbial Technology. - 2003. -V.32. - Issue 2. - P. 305-311.
22. Samuels, G. J. Trichoderma A review of biology and systematics of the genus [Text] / G.J. Samuels // Mycol. Res. – 1996. – V. 100. – Р. 923-935.
23. Samuels, G. J. The Hypocrea schweinitzii coplex and Trichoderma sect. Longibrachiatum [Text] / G. J. Samuels, O. Petrini, K. Kuhls, E. Lieckfeldt, C. P. Kubicek // Studies in Mycology. - 2001. - №41. - Р. 1-54.
24. Samuels, G. J. Trichoderma stromaticum sp. nov., a parasite of the cacao witches broom pathogen [Text] / G. J. Samuels, R. Pardo-Schultheiss, K. P. Hebbar, R. D. Lumsden., C. N. Bastos, J. C. Costa, J. L. Bezerra // Mycol. Res. - 2003. - V.104. - Р. 760-764.
25. Saha, B. C. Production, purification and properties of xylanase from a newly isolated Fusarium proliferatum [Text] / B. C. Saha // Process Biochemistry. - 2002. - V.37. - Issue 11. - P. 1279-1284.
26. Tison, M. C. Molecular determinants of substrate and inhibitor specificities of the Penicillium griseofulvum family 11 xylanases [Text] /  M.C. Tison, G.Andre-Leroux, M. Lafond, J. Georis, N. Juge, J. Berrin // Biochimica et Biphysica Acta 1794.– 2009. – P. 438 – 445.