Министерство  образования и  науки РФ

     Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Казанский (Приволжский) федеральный Университет»

     БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ  ФАКУЛЬТЕТ 

     КАФЕДРА БИОХИМИИ

     Специальность: 011600 (020208) - биохимия 
 

     КУРСОВАЯ  РАБОТА 

     Биосинтез ксиланаз аборигенными штаммами Trichoderma 

     Студент III курса

     Группа 180

     «__» ________ 2011 г.  ________________(Э.Л. Перес Хусаенова)

     Научные руководители 

     к.б.н.,с.н.с.

     «__» ________2011г.  ________________(Р.И. Тухбатова) 

     д.б.н., профессор

     «__» ________2011г.  ________________(Ф.К. Алимова) 
 

     Казань - 2011 

     СОДЕРЖАНИЕ

     ВВЕДЕНИЕ

 

     Ксилан  – второй по распространенности природный полимер после целлюлозы, он встречается практически во всех растительных тканях.

     Во  многих технологических процессах, прежде всего при производстве бумаги и целлюлозы, ксилан является нежелательной примесью, и встает проблема его деградации. Также необходимо гидролизовать ксилан в некоторых процессах пищевой и кормовой промышленности, и при комплексной переработке растительных отходов.

     Гидролиз  ксилана возможно осуществлять с  помощью химических реагентов или  ферментативным путем. Ферментативный гидролиз является предпочтительным, так как меньше влияет на структуру  других волокон, и при нем образуется меньше химических отходов. В пищевой или кормовой промышленности, химический гидролиз вообще неприемлем.

     В современной промышленности используются ксиланазы бактериального и грибного происхождения.

     Изучение  синтеза ксиланолитических ферментов  мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения.

     В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В связи с этим целью данной работы явилось изучение биосинтеза ксиланаз грибами рода Trichoderma на послеспиртовой барде.

     Исходя  из цели работы, были поставлены следующие  задачи:

1. Определить динамику ксиланазной активности при культивировании грибов рода Trichoderma на послеспиртовой барде.
2. Определить влияние редуцирующих сахаров культуральной среды на динамику синтеза гидролитических экзоферментов Trichoderma.
3. Определить влияние pH на активность ксиланаз.

     1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

     1.1 Общая характеристика  рода Trichoderma

     Грибы рода Trichoderma являются сапротрофами, способными усваивать большой спектр органических веществ и обладающими способностью активно подавлять конкурентов.

     Представителей  рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере частично, ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенна [Кучмина с соавт., 2001]. Грибы рода Trichoderma обильнее размножаются в почвах, богатых органическими веществами, т.к. количество углерода и азота и соотношение этих элементов в значительной степени влияют на развитие Trichoderma. Наиболее заметны эти грибы на мёртвой древесине [Samuels, 1996]. Из выше указанного видно, что грибы рода Trichoderma встречаются повсеместно, и распространение отдельных видов зависит в основном от абиотических факторов окружающей среды (температура, влажность субстрата и содержание органических веществ).

     На  сегодняшний день этот род делят  на три секции по по морфологическим характеристикам:

     Trichoderma sect. Triсhoderma, Trichoderma sect. Pachybasium, Trichoderma sect. Longibraсhiatum. Бесспорно только выделение секции Longibrachiatum, так как доказано её монофилетическое происхождение [Samuels et al., 2001], а секции Trichoderma и Pachybasium имеют полифилетическое происхождение и деление на их чисто искусственное [Крапивина с соавт., 1975].

     На  данный момент описано около 200 видов  Hypocrea, и около половины из них имеет анаморфу, относящуюся к роду Trichoderma. Т.о. существует, по крайней мере, 100 естественных видов Trichoderma, но, возможно, их ещё больше, поскольку клоны, потерявшие способность к половому размножению, могут эволюционировать самостоятельно [Samuels et al., 2003].

     1.2 Ферменты, их свойства

     Будучи  белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов [Campbell, Bedford, 1992]. Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента.

     По  характеру катализируемых процессов  ферменты делят на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы, которые представлены в таблице 1.

     Таблица 1

     Классы  ферментов

 

     Гидролазы – ферменты, катализирующие разрыв внутримолекулярных связей, при участии  воды. В зависимости от химической природы гидролизуемого субстрата  этот большой класс ферментов подразделяется на тринадцать подклассов. Один из них гликозидазы – ферменты, ускоряющие гидролиз гликозидов, ди-, три- и полисахаридов. К ним относятся ксиланазы – ферменты, гидролизующие полимерные цепочки ксиланов, и целлюлазы – ферменты, гидролизующие β-1,4- связи целлюлозы.

     1.3 Ферменты микромицета рода Trichoderma

     Ферменты, секретируемые Trichoderma, характеризуются сложностью состава. Есть данные о способности у диких штаммов к секреции эндохитиназ, хитобиозидаз, β-N-ацетилгексозаминидаз, β-1,6-глюканаз, протеаз, ДНКаз, целлюлаз, ксиланаз, уреаз, РНКаз, пектиназ, пектинлиаз, лактаз, пероксидаз [Маркович, Кононова, 2003].

     Большинство штаммов Trichoderma описано в научной литературе в качестве целлюлолитиков и гемицеллюлолитиков.

     В настоящее время, в связи с большой востребованностью в сельском хозяйстве, производстве чистящих средств и перерабатывающей промышленности [Сabrera et.al., 2010], производство гидролитических ферментов является крупнотоннажным процессом. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз различные штаммы T. reesei и T. longibrachiatum играют ведущую роль [Шульга, 2008]. Грибы Trichoderma также являются эффективными продуцентами ксиланаз. Кроме того, известно, что грибы рода Trichoderma являются продуцентами метаболитов, обладающих высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Чрезвычайно перспективными представляются в этом отношении грибы T. citrinoviride, T. asperellum,T. hamatum, T. harzianum. Описано получение из культуральной жидкости этих грибов антибиотиков – пептабойлов. Показано, что эти антибиотики высокоактивны в отношении грибов, грамположительных бактерий и микобактерий [Шариков с соавт., 2011].

     1.4 Гидролазы грибов

     В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В то же время, постоянно ведется поиск новых продуцентов, вызванный потребностью в ферментах с улучшенными свойствами, и желанием расширить спектр существующих продуцентов [Серебряный, 2009]. В качестве продуцентов ксиланаз, в настоящее время также используют грибы рода Humicola и Penicillium [Алимова с соавт., 2007].

     При культивировании Aspergillus sulphureus твердофазным способом было отмечено существенное влияние температуры и влажности на биосинтез гидролаз [Lu et al., 2003]. Подходящие условия для синтеза ксиланаз 30-35ºС, влажность 40-50%. В ходе культивирования выделяется значительное количество теплоты. Эффективно поддерживать температуру ферментации позволяет вентилирование субстрата. Применение описанной технологии позволяет получить препарат ксиланаз активностью 1000 IU/г, в сравнении с 650 IU/г при культивировании на сухом субстрате [Saha, 2002]

     1.5 Характеристика ксиланазного комплекса Trichoderma

     Ксиланазы – ферменты, гидролизующие линейные полисахариды бета-1,4 – ксилана в ксилозу, таким образом, деградирует гемицеллюлозы, одни из основных составляющих растительной клеточной стенки. Их относят по международной классификации ферментов к гликозидазам. Большинство грибных ксиланаз принадлежат к 10-му и 11-му семействам гликозил-гидролаз, различающихся по своим физическим свойствам, по субстратной специфичности и оптимуму рН. Многие грибы имеют гены, кодирующие несколько различных ксиланаз, принадлежащих как к одному, так и к разным семействам, и синтезируют несколько ксиланаз одновременно [de Vries R.P., 2002]. У некоторых видов обнаружен синтез только одного фермента.

     Все ксиланазы являются двухкомпонентными ферментами, они содержат белковую и углеводную составляющие. Для полного гидролиза ксилана необходимо участие следующих ферментов: эндоксиланаза ЕС3.2.1.8, экзоксиланаза ЕС3.2.1.37, b-D-ксилозидаза ЕС3.2.1.37, a-L-арабинофуранизидаза ЕС 3.2.1.55 [Марков с соав., 2006].

     Основным  ферментом, деполимеризующим ксилан, является эндо-β-l,4-ксиланаза - ксиланаза II [Lopez et al., 2011]. Этот фермент расщепляет главным образом центральные части основной цепи ксилана. Остальные ферменты работают синергично с ней. Экзоксиланаза и b-D-ксилозидаза атакуют короткие полимерные цепочки ксилана – продукты гидролиза эндо-β-l,4-ксиланазы. a-L-арабинофуранизидаза гидролизует боковые цепочки, создавая новые сайты для эндо-ксиланазы.

     1.6 Строение ксилана

     Перспективное направление биотехнологии – биоконверсия растительной массы в целях получения биотоплива (этанола и бутанола) в качестве конечного продукта. Ключевой стадией этого процесса является ферментный гидролиз биомассы до сбраживаемых сахаров. Поскольку некоторые микроорганизмы способны превращать пентозы (ксилозу и арабинозу) в этанол и бутанол, дополнительным источником биотоплива могут быть растительные ксиланы. Ксилан является основным гемицеллюлозным компонентом клеточной стенки растений и вторым по распространенности природным полисахаридом после целлюлозы [Семёнова и др., 2009]. В зависимости от происхождения, структура и химический состав ксилана значительно меняются, но, в любом случае, главная цепь образована β-1,4-связанными остатками D-ксилозы. В качестве ответвлений встречаются различные заместители, чаще всего арабиноза [Серебряный, 2009].