Так как структура ксилана у разных видов растений разная, требуется большое разнообразие объединено действующих ферментов таких как – ксиланаза, ксилозидаза, арабинофуранозидаза, ацетилксилан эстераза. Эти ферменты действуют совместно, разлагая ксилан до сахаров [Tison et.al., 2009].

     Во  многих технологических процессах, прежде всего при производстве бумаги и целлюлозы, ксилан является нежелательной  примесью, и встает проблема его  деградации. Также необходимо гидролизовать  ксилан в некоторых процессах  пищевой и кормовой промышленности, и при комплексной переработке растительных отходов. Гидролиз ксилана возможно осуществлять с помощью химических реагентов или ферментативным путем. Ферментативный гидролиз является предпочтительным, так как меньше влияет на структуру других волокон, и при нем образуется меньше химических отходов. В пищевой или кормовой промышленности, химический гидролиз вообще неприемлем [Серебряный, 2009].

     Не  смотря на то, что для исчерпывающего ферментативного гидролиза ксилана, включающего расщепление боковых цепей, требуется достаточно широкий спектр ферментов, в большинстве технологических процессов достаточно действия фермента, расщепляющего главную цепь ксилана – эндо-β-1,4-ксиланазы.

     Ксилан  составляет до 30% от общего количества полисахаридов в клеточных стенках растений. В зависимости от источника и способов выделения природные ксиланы могут иметь как линейную, так и разветвлённую форму [Марков с соавт., 2006]. Наиболее распространённым типом природных ксиланов является глюкуроноксилан – основной ксилан твёрдых (лиственных) пород деревьев и арабиноксилан, входящий в состав древесины мягких (хвойных) пород деревьев, а также ксилан злаковых растений.

     1.7 Биосинтез ксиланаз

     Гриб  – продуцент ксиланаз значительно  увеличивает синтез ферментов при наличии в среде специфических веществ-индукторов, как правило, являющихся продуктами неполного гидролиза субстрата. Благодаря наличию такого специфического биохимического механизма регулирования, генетический аппарат клетки настраивается на синтез такого ферментного комплекса, который, поступая во внешнюю среду, способствует максимальному гидролизу субстрата. Так при использовании «химических» индукторов, таких как очищенные микроцеллюлоза и глюкан, было отмечено увеличение выхода фермента и снижение  его себестоимости [Околелова с соавт., 2001].

     B результате изучения процесса  культивирования Trichoderma reesei в диапазоне рН 4.8 – 7.0 и анализа активности экзогенных ксиланаз установлено, что оптимальное рН синтеза ксиланаз 6.4 – 6.7. Максимум активности ферментов достигается при рН 4.8, величина оптимума в данном случае практически совпадает с физиологическим оптимумом рН=5,0 в верхних отделах тонкого кишечника [Colina A et al, 2003].

     1.8 Послеспиртовая барда

     При производстве спирта из зерна (например, пшеницы, кукурузы или ржи) получается довольно большое количество отработанной массы прошедшего ферментацию сырья, из которого путем дистилляции извлекается алкоголь [Шишкин с соавт., 2007]. В настоящее время в пищевых перерабатывающих отраслях промышленности России, и в частности в спиртовой промышленности, продолжает остро стоять проблема переработки вторичных ресурсов, образующихся в процессе производства пищевой продукции [Ненайденко, 2008]. Ее необходимо решать на уровне каждого спиртового завода. Причин тому, по меньшей мере, две: барда имеет ограниченный сбыт в качестве корма, не покрывающий объемы ее производства, а во-вторых, барда содержит большое количество ценных веществ, таких как протеины, связанные сахара, минеральные и органические соли и т.д. и может с успехом использоваться для получения топлива, ферментных препаратов или органических удобрений. В мировой и отечественной практике используется несколько типовых технологических процессов, которые в той или иной степени способны решить проблему переработки барды. К основным типовым схемам относятся:

1. переработка барды с получением сухой барды или кормовой добавки DDGS;
2. переработка барды с получением кормовых дрожжей;
3. переработка барды с использованием метанового брожения и получения газа метана [Ненайденко,2008].

     Интерес к использованию белковой и полисахаридной фракций барды растет, поскольку они могут использоваться как функциональная диетическая добавка для лечения кишечных расстройств, либо как альтернативный источник белка и углеводов в рационе животных [Новик с соавт., 2007].

     Барда зерновая используется в натуральном  виде при откорме сельскохозяйственных животных и птиц, а также при  производстве сбалансированных кормопродуктов. Образуется зерновая барда в виде жидкой суспензии от светло-желтого до темно-коричневого цвета.

     Зерновая  барда, получаемая на спиртовых заводах, перерабатывающих различное зерновое сырье, содержит различные питательные  компоненты (таблица 2) и является ценным питательным белково-углеводным продуктом (таблица 3). Образуется зерновая барда в количестве 120.0 – 148.0 м3/1000дал спирта с содержанием сухих веществ 5.8 – 9.0%.

     Таблица 2

     Органолептические и физико-химические показатели барды

     Таблица 3

     Содержание  веществ барды

     Послеспиртовую  барду можно использовать для культивирования микромицетов рода Trichoderma. В настоящее время для культивирования грибов, как правило, используются среды, полученные путем экстрагирования зерна злаков. Приготовление таких сред требует много времени и финансовых затрат. А послеспиртовая барда - это дешевый отход спиртового производства, не требующий больших затрат для использования в качестве культуральной среды грибов Trichoderma для биосинтеза ферментов.

     ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

     2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

     2.1 Использованные  изоляты

     В работе были использованы штаммы грибов рода T. citrinoviride 207, 207(1), 207(2), выделенные из почвы Больше-Кляринского городища Камско-Устьинского района РТ.

     2.2 Питательные среды, для культивирования микроорганизмов

     Картофельно-глюкозный  агар (КГА) (г/л):

     отвар картофеля – 200, глюкоза – 20, агар – 20.

     Послеспиртовая  барда.

     2.3 Культивирование грибов на послеспиртовой барде

     Для культивирования грибов использовали отход спиртового производства –  осаждённую послеспиртовую барду с добавками:

1. КН₂РО₄ (15 г/л) – фосфаты необходимы для cинтеза нуклеиновых кислот, АТФ, которые в свою очередь нужны для обеспечения процесса роста и энергообеспечения Trichoderma,
2. (NH₄)₂SO₄ (4.8 г/л) – источник азота, который необходим для синтеза белка,
3. СаСl₂ (0.3 г/л) – из литературы известно, что дефицит Ca²⁺ негативно влияет на жизнедеятельность Trichoderma,
4. МgSO₄*7H₂O (0.3 г/л) – Mg²⁺ необходим для работы ДНК- полимеразы,
5. Мочевина (4.8 г/л) – дешёвый источник азота,
6. Целлюлоза – индуктор синтеза ксиланаз,
7. Tween – эмульгатор, увеличивает проницаемость клеточных стенок и ускоряет выход ферментов в раствор, предотвращает коагуляцию белка.

     Корректировку рН в диапазоне 4.0-6.5 проводили соляной кислотой или раствором аммиака.

     Культивирование проводили в колбах объёмом 250 мл, в каждую наливали по 50 мл среды. Затем в каждую колбу добавляли целлюлозу – 5 г/л и Тween 80 – 2 г/л. Затем автоклавировали при 120˚С в течении 40 минут.

     Культуры  грибов для инокуляции выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в пробирках. Инокуляцию проводили следующим образом: делали смыв со скошенного агара 8 мл стерильной воды. В каждую колбу добавляли 150 мл инокулята на литр барды.

     Культивирование осуществлялось при 28°С, 130 об/мин (LOIP LS 110, устройство перемешивающее). Отбор проб проводили каждые 24 часа. Длительность культивирования составляла 7 суток.

     2.4. Определение ксиланазной активности

     Исследование  проводили в двух повторностях. Разбавленный образец в количестве 0.06 мл помещали в пробирку. Пробирку помещали на 5 минут в 50°С на водяную баню. Добавляли 0.6 мл субстрата и перемешивали. Через 20 минут инкубация прерывалась добавлением 0.3 мл раствора динитросалициловой кислоты (DNSA) [König et al., 2002].

     Субстрат  для исследования активности ксиланаз готовили следующим образом, 750 мг ксилана (Sigma X0502) помещали в 40 мл ацетатного буфера. Растворяли ксилан перемешиванием на кипящей водяной бане в течение 5 минут. После охлаждения до комнатной температуры рН раствора доводили 25% HCl до 5.0. Объем раствора доводили до 50 мл ацетатным буфером.

     Для построения калибровочного графика  стандарты ксилозы помещали в 0.06 мл ацетатного буфера в пробирку. Образцы  не инкубировали при 50°С, а сразу добавляли DNSA.

     После окончания описанной процедуры  для образцов и стандартов растворы в пробирках центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость. Полученный раствор инкубировали точно 10 минут в кипящей водяной бане, затем охлаждали в ледяной бане 5 минут, добавляли 3 мл воды и перемешивали. Измерение проводили при 540 нм, используя спектрофотометр Shimadzu UV-1800, Япония. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих сахаров в минуту при гидролизе соответствующего субстрата. Выход восстанавливающих сахаров определяли по калибровочным графикам, построенным по ксилозе, соответственно. Для расчета применяли следующую формулу: