Производство спирта

      Кальций играет роль активатора в микробной  клетке и обнаруживается в ней  как в свободной форме, так  и в связанной — с протеинами, углеводами и липидами. Ионы Са²⁺ могут связываться с АТФ наряду с Mg²⁺ и Мп²⁺. Кальций является кофактором транскетолазы хлебопекарных дрожжей и ингибитором некоторых ферментов, например пирофосфатазы, энолазы и аденозинтрифосфатазы. При повышенном содержании солей кальция угнетается размножение дрожжей, снижается накопление в них гликогена и повышается содержание стеринов. Так, при содержании Са²⁺ до 40 мг на 1 л среды стимулируется размножение дрожжей, при большем оно угнетается.

      Микроэлементы. Они имеют важное значение для размножения и жизнедеятельности дрожжей, входя в состав ферментов, витаминов и других соединений, участвующих в их синтезе. Микроэлементы влияют на скорость и характер различных биохимических процессов. Например, кобальт стимулирует размножение дрожжей, повышает содержание в клетках азотистых веществ небелковой природы, прежде всего ДНК, РНК и свободных аминокислот. Он стимулирует также синтез витаминов — рибофлавина и аскорбиновой кислоты. Стимулирующее действие микроэлементов объясняется тем, что они образуют с ферментами металлоорганические и внутри комплексные соединения. Получаемый эффект зависит от прочности связи фермента с молекулой субстрата или активации субстрата в промежуточном активном комплексе.

      Витамины  и другие факторы  роста. Для нормального развития и спиртового брожения дрожжи нуждаются в витаминах, которые являются кофакторами многих ферментов. Сахаромицеты в большей или меньшей мере могут синтезировать все витамины, за исключением биотина, который должен обязательно содержаться в питательной среде.

      Ненасыщенные  жирные кислоты с 18 атомами углерода, особенно олеиновая, также являются важными ростовыми факторами. Стимулирующее влияние олеиновой кислоты наблюдается только при малой ее концентрации, не превышающей 0,5 мг/мл. При увеличении концентрации рост дрожжей намного замедляется.

      ВИДЫ  И ИСТОЧНИКИ ПИТАНИЯ

      Различают экзогенное и эндогенное питание  дрожжей: при экзогенном питательные  вещества поступают в клетку из внешней среды, при эндогенном дрожжи используют (в основном при голодании) свои резервные вещества: гликоген, трегалозу, липи- ды, азотистые соединения.

      Углеродное  питание. Дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) используют углерод из различных органических соединений: глюкозы, маннозы, галактозы, фруктозы (D-формы). Пентозы Sacch. cerevisiae не ассимилирует. В отсутствие гексоз источником углерода могут служить также глицерин, маннит, этиловый и другие спирты, органические кислоты (молочная, уксусная, яблочная, лимонная).

      Следует учитывать полиауксию — последовательность потребления различных источников углерода. При периодическом культивировании в первую очередь потребляются глюкоза и фруктоза. Последовательность усвоения жирных кислот зависит от расы применяемых дрожжей и состава этих кислот. Например, уксусная кислота препятствует потреблению молочной, а молочная — гликолевой. Уксусная кислота и глюкоза усваиваются одновременно. Как правило, в первую очередь усваивается из смеси тот источник углерода, который обеспечивает большую скорость роста дрожжей.

      При непрерывном культивировании дрожжей  с увеличением скорости разбавления  среды в ней остается больше углеродного  компонента, который усваивается  последним.

      Различные виды дрожжей неодинаково относятся  к ассимиляции одних и тех же веществ. Дрожжи Sacch. cerevisiae начинают сбраживать галактозу только на вторые сутки.

      Дисахариды, из которых спиртовые дрожжи используют мальтозу и сахарозу, предварительно подвергаются гидролизу соответствующими ферментами дрожжей до моносахаридов. При переходе от анаэробных условий к аэробным ослабляется способность дрожжей сбраживать глюкозу и мальтозу, а сахарозная активность их повышается в 2,5 раза. Дрожжи потребляют мальтозу только при отсутствии в среде фруктозы и глюкозы. Мальтоза сбраживается почти полностью во время стационарной фазы роста дрожжей.

      Органические  кислоты имеют важное значение в метаболизме углерода, энергетическом обмене микроорганизмов, синтетических и диссимиляционных процессах. Использование кислот жирного ряда в качестве источника углерода зависит от вида и расы дрожжей, концентрации кислоты, длины ее углеродной цепи и степени электролитической диссоциации. Хорошими субстратами служат кислоты с длиной углеродной цепи от Сг до С4 (уксусная, пировиноградная, молочная, масляная и др.) при сравнительно низкой концентрации. Калийные соли кислот, содержащих в молекуле от 2 до 5 атомов углерода, стимулируют рост дрожжей в 1,4...3,3 раза сильнее по сравнению с соответствующими кислотами.

      Жирные  кислоты со средней длиной углеродной цепи (от Сб до Сю) в меньшей мере потребляются дрожжами и только в условиях очень низкой концентрации (0,02...0,05 %). При более высокой концентрации развитие дрожжей подавляется. Жирные кислоты с 12... 17 атомами углерода в молекуле усваиваются избирательно в зависимости от рода и вида дрожжей.

      Любой из промежуточных продуктов цикла  Кребса (пировиноградная, лимонная, янтарная, фумаровая, яблочная кислоты) может быть единственным источником углерода для жизнедеятельности дрожжей.

      Азотное питание. Дрожжи способны синтезировать все аминокислоты, входящие в состав их белка, непосредственно из неорганических азотистых соединений при использовании в качестве источника углерода органических соединений — промежуточных продуктов распада углеводов, которые образуются при дыхании и брожении.

      Дрожжи  Sacch. cerevisiae усваивают лишь две формы азота: аммиачный и органических веществ. Эти микроорганизмы эффективно используют азот сульфата и фосфата аммония, мочевины, аммиачных солей уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот. В присутствии сбраживаемых Сахаров аммиачные соли являются для дрожжей источником лишь азота; однако при потреблении его освобождаются кислоты, изменяющие рН среды. Аммиачный азот потребляется дрожжами лучше, чем азот многих аминокислот.

      Аминокислоты  — одновременно источник азота и  углерода, причем последний усваивается  из кетокислот, образующихся в результате отщепления аминогрупп. Возможна и  непосредственная ассимиляция аминокислот из питательной среды, содержащей их полный набор и какой-либо сбраживаемый сахар. Вследствие этого снижается расход сахара среды на питание дрожжей и несколько увеличивается выход спирта при брожении.

      Благодаря ассимиляции аминокислот обеспечивается синтез белка, в том числе и  ферментов, активируются некоторые  уже имеющиеся в клетке ферменты, ускоряется процесс почкования дрожжевых  клеток.

      Для потребления органического азота (аминокислот, амидов) многим дрожжам  необходимы витамины (биотин, пантотеновая кислота, тиамин, пиридоксин и др.). Дрожжи не усваивают такие азотистые  соединения, как белки, бетаин, холин, пурины и амины в виде этиламина, пропил- и бутиламина. Пептиды занимают среднее положение между аминокислотами и белками. Потребление дрожжами пептидов снижается с повышением их сложности. Некоторое количество пептидов в среде наряду с другими формами азота способствует использованию аминокислот.

      На  образование 10 млрд дрожжевых клеток расход азота в условиях анаэробиоза составляет 66...77 мг, в условиях аэробиоза 37...53 мг. Об условиях культивирования и физиологическом состоянии дрожжей судят по содержанию азота в них, которое зависит от состава среды, количества дополнительно вводимых питательных веществ и от расы дрожжей. В дрожжах, полученных на спиртовых заводах, общего азота 7... 10 % (иногда до 12 %) на сухое вещество.

      Фосфорное питание. В анаэробных условиях дрожжи усваивают фосфор главным образом в начальный период брожения — 80...90 % от максимального количества в дрожжах. Молодые, энергично размножающиеся дрожжевые клетки богаче фосфором по сравнению с непочкующимися старыми. Например, после 6 ч брожения дрожжи содержат 2,15 % фосфора на сухое вещество, к концу брожения — только 1 %.

      В сусле из крахмалистого сырья  имеется достаточное количество усваиваемых дрожжами фосфорсодержащих соединений, в мелассном сусле их недостаточно, и приходится добавлять орто- фосфорную кислоту.

      ПРОЧИЕ  ФАКТОРЫ

      Скорость  роста дрожжей зависит от разности осмотического давления в клетке и в сусле: чем она больше, тем  быстрее размножаются дрожжи. Вследствие этого более активное физиологическое состояние дрожжей наблюдается при сбраживании мелассы по двухпоточному способу. При обработке спиртовых дрожжей ультразвуком в несколько раз возрастает активность инвертазы, в некоторых случаях стимулируется их рост.

      Под влиянием у-лучей у винных дрожжей повышается бродильная. При облучении ультрафиолетовыми лучами дрожжи теряют способность синтезировать лейцин, изолейцин и валин. Таким образом были получены мутанты, не образующие изоамилового и изобутилового спирта.

      Спирты, эфиры и слабые растворы щелочей  растворяют липо- идные вещества клеток дрожжей. Спирты даже в небольших концентрациях (3...4 %) тормозят почкование дрожжей. Однако в непрерывном потоке сбраживаемой среды дрожжи способны размножаться при относительно высокой концентрации спирта (7...8 об. %) и продолжать сбраживать сахара до концентрации спирта 10... 12 об. %. Размножение дрожжей при непрерывном брожении зависит главным образом от содержания питательных веществ и меньше от количества спирта в среде.

      Формалин, кислоты и соли тяжелых металлов относятся к плазматическим ядам. Небольшое количество формалина (0,09 %) нарушает нормальную жизнедеятельность  дрожжей, а доза 0,001 % тормозит их почкование. Обычно дозы веществ, снижающие бродильную энергию дрожжей, значительно выше доз, задерживающих почкование.

      Сернистая, азотистая и фтористоводородная кислоты и их соли в очень малых  концентрациях препятствуют нормальному  росту дрожжей: диоксид серы в  концентрации 0,0025 %, нитриты — 0,0005 %. При содержании в мелассе 0,02 % диоксида серы качество дрожжей значительно ухудшается — они быстро темнеют, понижаются их подъемная сила и стойкость при хранении.

      В растворах серной кислоты концентрацией 0,35...0,6 % через 15 мин все клетки дрожжей  сохраняют жизнеспособность; через 24 ч насчитывается лишь 2 % мертвых  клеток. Молочнокислые бактерии в 0,15%-ном  растворе серной кислоты уже через 2 ч погибают, в 0,5%-ном растворе в  течение такого же времени погибают все бактерии. Дикие дрожжи могут  переносить воздействие 1,3%-ной серной кислоты в течение 2 ч.

      Свободные органические кислоты оказывают  большее инги- бирующее действие на дрожжи, чем их соли. Летучие органические кислоты даже в незначительных концентрациях подавляют размножение и ускоряют их отмирание. Наиболее сильные ингибиторы — масляная и капроновая кислоты. Особенно чувствительны дрожжи к летучим органическим кислотам при снижении рН среды до 4. В этих условиях через сутки в дрожжевой популяции наблюдается большое количество плазмолизированных клеток и почек.

      При большом засеве (120... 150 млн клеток на 1 мл) и рН бражки 5,1 коэффициент размножения дрожжей расы В в контрольном варианте 2,1, а при содержании 0,02 % масляной кислоты — 1,2, при содержании 0,02 % капроновой кислоты — 1,15. Количество мертвых клеток дрожжей рас В и Я составляло 21...52 %. В присутствии пропионовой кислоты коэффициент размножения дрожжей рас В и Я в 1,5, а количество мертвых клеток — в 2 раза меньше, чем в контрольном варианте.

      Муравьиная  кислота снижает коэффициент  размножения дрожжей, не вызывая  отмирания клеток. Уксусная кислота  — сравнительно слабый ингибитор.

      Некоторые тяжелые металлы в весьма малых  концентрациях убивают дрожжевые  клетки (серебро — 0,000001 %, медь — 0,005 %), а в концентрациях, не поддающихся  определению химическим анализом, тормозят рост дрожжей. Бактерицидное действие тяжелых металлов зависит от состава среды, ее кислотности, температуры и плотности дрожжевой популяции. Например, соли меди в кислых средах более ядовиты, соли серебра проявляют более сильное бактерицидное действие в виде аммиачных растворов.

      В случае присутствия фурфурола в  сбраживаемой среде уменьшаются количество почкующихся клеток и их размер. Даже при незначительном содержании фурфурола снижается мальтазная и зимазная активность выделенных из мелассной бражки дрожжей.

      Сульфонол в небольших концентрациях (70...100 г на 1 т мелассы) не влияет на жизнедеятельность дрожжей и подавляет молочнокислую микрофлору. Хлор, хлорная известь, марганцовокислый калий, сильно окисляя органические вещества, разрушают их.

      В бражках с повышенным содержанием  ионов Са, Mg, Fe у дрожжевых клеток теряется водная оболочка, в связи с чем уменьшаются ионная сфера и электрический заряд на поверхности клеток и создаются условия для агглютинации дрожжей.

      Спиртовые расы дрожжей имеют отрицательный  электрокинетический потенциал: от —7 до —13 мВ, вследствие чего они адсорбируют на своей поверхности меланоидины с положительным потенциалом. С понижением рН среды электрокинетический потенциал меланоидинов возрастает, в связи с чем увеличивается степень адсорбции их на дрожжевых клетках. Меланоидины придают дрожжам темный цвет, способствуют отмиранию дрожжевых клеток и, следовательно, снижению их ферментативной активности, в частности_чактивности инвертазы и каталазы. При содержании в сбраживаемой среде меланоидинов от 0,005 до 0,3 г на 100 мл через 24 ч популяция дрожжей уменьшается в 1,3...2 раза.