Производство спирта

     Пируваткиназа

     Следующим шагом, где осуществляется регуляция  гликолиза, является последняя реакция — этап действия пируваткиназы. Для пируваткиназы также описан ряд изоферментов, имеющих особенности регуляции.

     Печёночная пируваткиназа (L-тип) регулируется при фосфорилировании, аллстерическими эффекторами и путём регуляции экспрессии генов. Фермент ингибируется АТФ и ацетил-КоА и активируется фруктозо-1,6-бифосфатом. Ингибирование пируваткиназы АТФ происходит подобно действию АТФ на ФФК. Связывание АТФ с сайтом ингибирования фермента уменьшает его сродство к фосфоенолпирувату. Печёночная пируваткиназа фосфорилируется и ингибируется протеинкиназой, и таким образом также находится под гормональным контролем. Кроме того, активность печёночной пируваткиназы регулируется и количественно, то есть изменением уровня его синтеза. Это медленная, долговременная регуляция. Увеличение в рационе углеводов стимулирует экспрессию генов, кодирующих пируваткиназу, в результате уровень фермента в клетке повышается.

     М-тип  пируваткиназы, найденный в головном мозге, мышцах и других глюкозо-потребных тканях не регулируется протеинкиназой. Это принципиально в том, что метаболизм этих тканей определяется только внутренними потребностями и не зависит от уровня глюкозы в крови.

     Мышечная  пируваткиназа не подвержена внешним влияниям, таким как понижение уровня глюкозы в крови или выброс гормонов. Внеклеточные условия, которые приводят к фосфорилированию и ингибированию печёночного изофермента, не изменяют активность пируваткиназы М-типа. То есть интенсивность гликолиза в поперечнополосатой мускулатуре определяется только условиями внутри клетки и не зависит от общей регуляции. 
 
 

     БИОХИМИЯ   БРОЖЕНИЯ   И   ДЫХАНИЯ

     АНАЭРОБНЫЙ   РАСПАД   УГЛЕВОДОВ

     Ферментативная  диссимиляция углеводов в анаэробных условиях, происходящая с выделением энергии и приводящая к образованию продуктов неполного окисления, называется брожением.

     При брожении акцептором водорода служат органические соединения, получающиеся в реакциях окисления (например, уксусный альдегид при спиртовом брожении); кислород в этих реакциях не участвует.  

     На  рисунке приведена схема химических превращений при спиртовом брожении глюкозы.

     1. Образуются фосфорные эфиры Сахаров.  Под действием фермента гексокиназы и адениловых кислот, являющихся донаторами и акцепторами фосфорной кислоты, глюкоза превращается в глюкопиранозо-6-фосфат. Адениловые кислоты в дрожжах содержатся в виде аденозинмонофосфата (АМФ), аденозиндифосфата (АДФ) и адеыозинтрифосфата (АТФ). Гексокиназа катализирует перенос одной фосфорной группы с АТФ на глюкозу. При этом АТФ превращается в АДФ, а остаток фосфорной кислоты присоединяется по месту шестого углеродного атома. Действие фермента активируется ионами магния. Подобным образом происходит превращение D-фруктозы и D-маннозы. Глюкокиназная реакция определяет скорость процесса брожения.

     2. Глюкозо-6-фосфат под действием  фермента глюкозофосфат — изомеразы подвергается изомеризации — превращению в фруктозо-6-фосфат. Реакция обратима и сдвинута в сторону фруктозо-6-фосфата.

     3. Фруктозо-6-фосфат под действием  фермента фосфофруктокпназы присоединяет по месту первого углеродного атома второй остаток фосфорной кислоты за счет АТФ и превращает в фруктозо-1,6-дифосфат. Эта реакция практически необратима. Молекула сахара переходит в оксоформу и становится лабильной, способной к дальнейшему превращению, так как ослабляется связь между третьим и четвертым углеродными атомами.

     4. Под действием фермента альдолазы (активируемой ионами Zn²⁺, Со²⁺ и Са²+) фруктозе-1,6-дифосфат распадается на две фосфотриозы — З-фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. Эта реакция обратима.

     5. Между фосфотриозами происходит реакция изомеризации, катализируемая ферментом триозофосфатизомеразой. Равновесие устанавливается при 95% 3-фосфоглицеринового альдегида и 5% фосфодиоксиацетона.

     6. В индукционный период, пока в  качестве промежуточного продукта  не образовался уксусный альдегид, между двумя молекулами 3-фосфоглицеринового альдегида под действием фермента альдегидмутазы при участии молекулы воды происходит реакция дпсмутации. При этом одна молекула фосфоглицеринового альдегида восстанавливается, образуя фосфоглицерин, другая окисляется в 3-фос-фоглицериновую кислоту. Фосфоглицерин в дальнейших реакциях не участвует н после отщепления фосфорной кислоты является побочным продуктом спиртового брожения.

     При установившемся процессе окисление 3-фосфоглицеринового альдегида в 3-фосфоглицериновую кислоту происходит сложным путем. Вначале он превращается в 1,3-дифосфоглицериновый альдегид, присоединяя остаток неорганической фосфорной кислоты, затем под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы в присутствии НАД (никотинамидадениндинуклеотида) окисляется в 1,3-дифосфо-глицсриновую кислоту. НАД, вступая в соединение со специфическим белком, образует анаэробную дегидрогеназу, обладающую способностью отнимать водород непосредственно от фосфоглицеринового альдегида и других органических соединений.

     7. При участии фермента фосфотрансферазы остаток фосфорной кислоты, содержащий макроэргическую связь, передается с 1,3-дифосфоглицериновой кислоты на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты. Энергия, освобождающаяся при окислении фосфоглицеринового альдегида, резервируется в АТФ.

     8. Под действием фермента фосфоглицеромутазы 3-фосфоглицериновая кислота изомеризуется в 2-фосфоглицериновую кислоту.

     9. В результате отдачи воды, вызываемой  перераспределением внутримолекулярной энергии, 2-фосфоглицериновая кислота превращается в фосфоэнолпировиноградную кислоту, содержащую макроэргическую связь. Реакцию катализирует энолаза, активируемая ионами Мg²+, Мn² + и Zn²+.

     Максимальное  действие энолазы проявляется в интервале рН 5,2—5,5. При рН 4,2 молекулы энолазы агрегируются, при рН 3—4 необратимо денатурируются.

     10. Под действием фермента фосфотрансферазы в присутствии ионов К⁺ остаток фосфорной кислоты передается от фосфоэнолпировиноградной кислоты на АДФ, резервируя энергию в АТФ.

     11. Образовавшаяся энолпировшюградная кислота превращается в более стабильную кетоформу.

     12. Под действием фермента карбоксилазы  от пировиноградной кислоты отщепляется диоксид углерода и образуется уксусный альдегид.

     13. Фермент алкогольдегидрогеназа переносит водород с восстановленного НАД-Н₂ на уксусный альдегид, в результате чего образуется этиловый спирт и регенерируется НАД.

     АЭРОБНЫЙ   РАСПАД   УГЛЕВОДОВ

     В условиях аэробиоза распад углеводов  до образования пировиноградной кислоты происходит так же, как и при анаэробиозе, но в отличие от него пировиноградная кислота полностью окисляется до диоксида углерода и воды в цикле трикарбоновых кислот — ЦТК (цикле Кребса, лимоннокислотном цикле). В этом цикле последовательно протекают окислительно-восстановительные реакции, в которых под действием специфических дегидрогеназ происходит перенос водорода на молекулярный кислород — конечный его акцептор. Однако перенос осуществляется не   непосредственно, ;   а    через    молекулы-переносчики, образующие так называемую дыхательную цепь. Схема химических превращений при аэробном распаде глюкозы приведена ниже.

     При катаболизме глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты. Вначале одна из них подвергается реакциям окислительного декарбоксилирования, в результате которых образуется ацетил-КоА (активированная уксусная кислота):  

     СНз·СО  ·  СООН + КоАSН + НАД — СНз-СО  ~  КоАSН + НАД · Н2  + СО2  

     Вторая  молекула пировиноградной кислоты под действием фермента пируваткарбоксилазы конденсируется с молекулой диоксида углерода с образованием щавелевоуксусной кислоты:

     СHз · CO · COOH + CO2  +  АТФ   ↔   HOOC · CH2  · CO · COOH  + АДФ  +  Ф

     При установившемся цикле щавеле-воуксусная кислота образуется из яблочной (малата).

     Собственно  ЦТК начинается с конденсации ацетил-КоА с молекулой щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетата), катализируемой ферментом цитратсинта-зой. Продуктами реакции являются лимонная кислота (цитрат) и свободный кофермент А:

     Дальнейшие  превращения видны из схемы на рисунке.

     За  один оборот молекулы пировиноградной  кислоты присоединяется 3 молекулы Н₂О, выделяется 5 Н₂ и образуется 3 молекулы СО₂:

     СНз  · СО  · СООН +  ЗН2О— ЗС0₂    +   10 Н.

     В ЦТК «сжигаются» не только углеводы, но и жирные кислоты (после предварительной деградации до ацетил-КоА), а также многие аминокислоты (после удаления аминогруппы в реакциях дезаминирования или переаминирования).

     Аэробный  и анаэробный распад углеводов доставляет дрожжам энергию и обеспечивает процессы синтеза биомассы различными предшественниками. Из щавелевоуксусной и а-кетоглутаровой кислот в результате восстановительного аминирования и переаминирования образуются соответственно аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Аспарагиновая кислота может образовываться также из фумаровой кислоты. Синтез этих двух аминокислот занимает главное место в синтезе белков из углеводов. При конденсации фос-фодиоксиацетона с альдегидами могут образовываться пентозы, гексозы и различные полисахариды. Для синтеза биомассы дрожжи используют и другие — анаплеротические — пути, например пенто-зофосфатный путь. Пентозофосфаты являются предшественниками нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

     Так как при полном окислении сахара значительно больше освобождается энергии и образуется реакционноспособных метаболитов для синтетических процессов, то возрастает скорость размножения и увеличивается биомасса дрожжей. 
 
 

     РАСХОД   САХАРА  НА  БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ  ПРОЦЕССЫ   И   ПРОДУКТЫ   БРОЖЕНИЯ

     Дрожжегенерирование — сложнейший биохимический процесс, состоящий из взаимосвязанных и тесно переплетающихся биохимических реакций, поэтому точно рассчитать расход питательных веществ на продукты дрожжегенерирования невозможно. В приближенных теоретических расчетах пользуются суммарными уравнениями процессов брожения и биосинтеза.

     Анализ  различных способов получения дрожжей  из мелассы показывает, что наибольший экономический коэффициент — процент сахара, израсходованного на получение товарной продукции, за вычетом потерь — получается при спиртовом брожении с утилизацией дрожжей (64,6%). На специализированных дрожжевых заводах экономический коэффициент ниже (42—45%).

          В процессе дрожжегенерирования сахар расходуется на получение трех основных продуктов: дрожжей, спирта и диоксида углерода. Чтобы максимально использовать сахар, необходимо утилизировать все названные продукты. При спиртовом брожении сахар, например, содержащийся в мелассе, расходуется на образование следующих веществ: этилового спирта (46—47,6%); диоксида углерода [в соответствии с количеством этилового спирта (44— 45,5%)]; биомассы дрожжей (1,8—4%); глицерина (3,2—4,5%); высших спиртов (0,28—0,7%); альдегидов (0,1—0,2%); органических кислот (0,2—1%). Потери несброженного сахара в бражке 2,1—2,8%. Общие потери сахара в процессе сбраживания 7—12% к введенному в производство. Соответственно и выход спирта составляет 88—93% к теоретическому.

     На  количество образовавшегося при  спиртовом брожении глицерина влияют состав сбраживаемой среды и ее физико-химические показатели.

     Расход  сахара на образование биомассы дрожжей  и их жизнедеятельность зависит от направленности процесса. Так, при работе по схеме с выделением дрожжей из зрелой мелассной бражки и использованием их в качестве хлебопекарных стремятся накопить возможно больше дрожжей. Дрожжи можно многократно возвращать на сбраживание, что сокращает расход сахара на образование биомассы дрожжей. Энергия брожения дрожжей при их 2— 4-кратном возврате не только не снижается, но даже несколько повышается. Кроме того, при многократном использовании увеличивается общее число дрожжевых клеток и возрастает интенсивность брожения.

     При сбраживании сусла в зрелой бражке содержится 20—35 г дрожжей 75%-ной  влажности в 1 л. В условиях анаэробного дыхания на образование 1 г дрожжей указанной влажности расходуется 0,4 г сахарозы, следовательно, на получение 20—50 г дрожжей потребляется 8—14 г сахара, или 6—11%.